浙贝母基因组DNA提取方法比较研究【毕业论文】.doc

1、 本科毕业设计 （ 20_ _届） 生物工程 浙贝母基因组 DNA 提取方法比较研究 摘 要 浙贝母（ Fritillaria thunbergii Miq.）是用于止咳化痰的常用中药，是著名的 “浙八味 ”之一，其药用成分为生物碱。本文分别以取自宁波市鄞州区章水的狭叶浙贝、宽叶浙贝、多籽浙贝叶片为材料，分别采用 CTAB 法、 SDS 法、高盐低 pH 法和试剂盒法来提取浙贝母基因组 DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计、 PCR 扩增对所提取的 DNA样品进行纯度和浓度及完整性检测，以寻找适合浙贝母基因组 DNA 的提 取方法。结果表明，用高盐低 pH 法提取的 DNA 浓度、纯度

2、和完整性都较高，从经济角度讲优于试剂盒提取法，是比较适合浙贝母新鲜叶片基因组 DNA 提取的方法。同时实验数据也表明上述四种方法都不适合浙贝母新鲜鳞茎组织基因组 DNA 的提取，而用 CTAB 法提取浙贝母鳞茎干粉基因组 DNA 的效果相对较好。由此表明，在进行浙贝母分子生物学研究时，采用新鲜叶片作为实验材料为宜。 关键词 ： 浙贝母；基因组 DNA；提取 ABSTRACT Fritillaria thunbergii Miq. is traditional Chinese medicine used to Cough expectorant, is the one of famous “zh

3、ejiang eight flavour“, its medicinal ingredients is alkaloid.The paper based on materials respectively from leaf water 、 broad leaf、 much seed of Fritillaria thunbergii Miq. in Zhangshui town of Yinzhou, CTAB method,SDS method,high salt low pH method and kit method were used to extract genomic DNA f

4、rom Fritillaria thunbergii Miq.,and through the agarose gelelectrophoresis, uv spectrophotometer, PCR to inspect purity ,concentration and completeness of DNA samples, to find suitable genomic DNA extraction method for Fritillaria thunbergii Miq. .The results show that using high salt low pH method

5、to extract DNA concentration, purity and integrity is higher, is better than kit extraction from the economic angle,is a suitable genomic DNA extraction method for fresh leaf of Fritillaria thunbergii Miq. Meanwhile, experiment data also show that the four methods of above are not suitable for Friti

6、llaria thunbergii Miq. fresh bulb organization genomic DNA extraction, but the effect of using CTAB method to extract Fritillaria thunbergii Miq.bulb powder genomic DNA Is relatively well. Thus, fresh leaf should adopt as experimental material in Fritillaria thunbergii Miq. molecular biology researc

7、h,. Key words: Fritillaria thunbergii Miq.;Genomic DNA; extractionI 目 录 1 前言 . 1 2 材料与方法 . 3 2.1 实验材料 . 3 2.1.1 材料 . 3 2.1.2 主要化学药品和试剂 . 3 2.1.3 主要仪器和设备 . 4 2.1.4 主要试剂及配制方法 . 5 2.1.5 其他材料 . 6 2.2 方法 . 6 2.2.1 材料的处理 . 6 2.2.2 浙贝母基因组 DNA 提取方法 . 6 2.2.3 紫外分光光度计检测 . 8 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳 . 8 2.2.5 琼脂糖凝胶染色成像 .

8、 9 3 结果与分析 . 10 3.1 不同方法 对浙贝母基因组 DNA 提取质量的影响 . 10 3.2 不同品种对浙贝母基因组 DNA 提取质量的影响 . 12 3.3 不同组织部位对浙贝母基因组 DNA 提取质量的影响 . 13 3.4 PCR 扩增 . 13 4 讨论 . 14 参考文献 . 15 1 1 前言 贝母为百合科多年生草本植物的鳞茎，是止咳化痰的一味常用中药。主要分为川贝母、浙贝母、伊贝母、平贝母和湖北贝母。 目前临床上应用的主要是浙贝母和川贝母。浙贝母（ Fritillaria thunbergii Miq.）又称大贝母、象贝母， 浙贝母的鳞茎干燥，性寒、味苦，具有清热散

9、结、化痰止咳、开郁之功效，是较为常用的中药材，也是著名的 “浙八味 ”之一 1。 在国内外享有盛誉。主产于浙江，在安徽、江苏等地也有产。 浙贝母以鳞茎入药， 性寒，味苦、甘， 药用价值很高，有清热、润肺、散结、止咳、化痰等治疗功能。是主治虚劳、肺燥、咳痰、咯血、心胸郁结、肺炎及急慢性支气管炎等病症的主要药物。历代的记载和近代研究资料表明，浙贝母不仅具有明显的 镇咳润肺作用，而且对呼吸系统、血液循环系统、中枢神经系统、抑制腺体分泌及散瞳等都有一定作用 2。 浙贝母性喜温暖湿润气候，适宜在 10 25 气温中生长，较耐寒，怕高温，忌渍水，要求土层深厚，对土壤质地要求严。光照，温度，水分，土壤质地等

10、都会影响浙贝母的生长，会直接的影响浙贝母的产量和品质，对其药用成分的形成、积累也会起到一定的影响 2。 浙贝母的种类包括狭叶浙贝，宽叶浙贝，轮叶浙贝，三芽浙贝，多籽浙贝，东贝母等，目前主要种植栽培的品种是狭叶浙贝，宽叶浙贝和多籽浙贝。狭叶浙贝母又称细叶种，原产地象山。株高 70 80 厘米，茎粗 0.6 0.7 厘米，茎直立，圆柱形，中空，外侧光滑无毛，茎杆表面有蜡质，主茎基部近地面 5 6 厘米棕色， 6 9 厘米为绿色， 9厘米以上与叶色相同。主杆上叶节长约 12.5 厘米。地下鳞茎表皮黄白色，呈扁球形，直径 3 6 厘米，单个重 40 克左右。叶色蓝绿，叶片呈披针形，叶尖卷曲，单叶，全缘

11、，叶长 8 10 厘米，下部叶宽 0.9 厘米，上部叶宽 0.65 厘米。顶部呈长条卷曲状，叶面光滑，有蜡质且较厚。鳞茎鲜品亩产 1500 千克左右，亩产干贝可达 300 千克左右。狭叶浙贝是宁波市鄞州区的主栽品种，栽培面积占当地浙贝 母种植总面积的 90%以上 1。宽叶浙贝母又称大叶种，竹叶种，原产宁波市樟村、岭下、鄞溪一带，是当地的地方品种，株高 72 78 厘米，茎粗 0.62 0.68 厘米，茎直立，圆柱形，中空，外侧光滑无毛，茎杆表面有蜡质，主茎基部近地面 7 9 厘米棕色或棕绿色， 9 13 厘米为棕绿过渡色， 13厘米以上为绿色。地下鳞茎表皮乳白或奶黄色，扁圆形，直径 3 6 厘

12、米，单个鳞茎重39 克左右。叶长 7 11 厘米，叶宽大于狭叶浙贝，宽约 1.3 厘米左右，叶尖平直，叶面光滑稍有蜡质。鳞茎鲜品亩产 1550 千克左右，亩产干贝可达 320 千克左右，产 量略高于狭叶浙贝 1。多籽种浙贝母又称多芽种。原产于宁波市鄞江一带， 20 世纪 80 年代初2 引入樟村。株型较小，高 64 厘米左右，茎粗 0.5 0.6 厘米，茎直立，圆柱形，中空，外侧光滑无毛，茎杆表面有蜡质，主茎基部近地面为棕色或棕绿色，上部为棕绿色。地下鳞茎单个重约 30.4 克，表皮乳白色。叶片呈披针形，叶尖平直，单叶，全缘，叶色深绿。叶长 7 11 厘米，叶宽大于狭叶浙贝，宽约 0.9 厘米

13、左右，且茎下部的叶要比茎上部的叶宽一些，叶面光滑，稍有蜡质。鳞茎鲜品亩产 1670 千克左右，亩产干贝可达 620千克左右 2。 众所周 知，基因组 DNA 的提取是进行各种分子生物学实验的基础， DNA 提取的得率和质量也或多或少的对后续实验结果有着影响。它是进行任何 DNA 工作（如 PCR、Southern blotting 和克隆等）的前提和基础，也是最关键的一步。不同植物核酸结合蛋白的情况各不相同，因而要采取不同的提取方法 3-6。而中药材中含有更为丰富的次生代谢产物，这些对 DNA 的提取都有着不可忽视的影响，所以中药材的 DNA 提取困难，有顽拗植物 7之称。探索中药材的 DNA

14、 提取方法有着重要的意义。目前采用的方法有以下几种： （ 1）十六烷基三乙基 溴化铵 (CTAB)法 CTAB 是一种阳离子去污剂，它能与核酸形成复合物，这些复合物在低盐溶液中会因溶解度的降低而沉淀，而在高盐溶液中可解离，从而使 DNA 和多糖分开，再用乙醇沉淀 DNA 而除去 CTAB。在该法中使用的聚维酮 (PVP)与多酚结合形成复合物，从而可有效避免多酚类化合物介导的 DNA 降解 8。 （ 2） SDS 法 为了避免 CTAB 法试验步骤多、操作繁琐的不足之处，近年来又提出了利用SDS2Tris2Cl-2EDTA 等直接裂解细胞使其释放出 DNA 的方法 9。在该法后续的 DNA 纯化

15、过程中通常采用酚 /氯仿处 理，但对于植物 DNA 纯化不是一个很好的选择，因为酚的使用可降低 DNA 的提取效率和纯度。 （ 3）氯化苄法 李思光等 10在对猕猴桃的基因组 DNA 提取过程中选用了氯化苄法，与其他方法相比该法的得率较高，其原因可能是氯化苄不仅可与植物细胞壁上的多糖羟基反应生成醚，而且与细胞液中多糖物质的羟基反应，起到破坏糖链的作用，利于 DNA 的释放和提纯。 （ 4）高盐低 pH 法 11 该法中所用的提纯试剂仅为无机盐和异丙醇。通常采用的无机盐为醋酸钾，低 pH3 的醋酸钾是有效的蛋白质沉淀剂。与一般氯仿 -异丙醇反复抽提去除蛋白质的操作 相比该法操作更方便省时，所需样

16、品量少，适用于濒危植物 DNA 的提取。 （ 5）果胶酶法 Steven 等 12采用果胶酶对植物细胞破碎后的抽提混合物进行消化处理使与 DNA 共沉淀的胶状物质分解成小的片段，从而无法与 DNA 一起沉淀下来，降低了 DNA 的纯化难度，提高纯化效率。 （ 6） DNA 试剂盒法 DNA 试剂盒法是实验室快速少量提取高纯度 DNA 的一种方法。由于其适用于多个样品同时操作，快速，准确，方便，无需酚等抽提，避免了有机质溶剂的污染，并且不含 PCR 反应抑制药及其他酶反应抑制药，可被各种限制性内切酶完全降解，在 科研中的地位慢慢开始受到重视。 本文在浙江宁波鄞州区章水、龙观、鄞江、金华磐安等地分

17、别采集了相同品种的浙贝母鳞茎，在鄞州区的章水采集了狭叶浙贝、宽叶浙贝、多籽浙贝三个不同品种的浙贝母的地上茎及叶。采用多种方法从中药材浙贝母的新鲜叶片中提取基因组 DNA，并且对这些方法进行比较，从中找出更为适宜的简单易操作的方法。这个研究也为开展浙贝母种质资源的遗传多样性分析以及分子鉴定奠定了基础。 2 材料与方法 2.1 实验材料 2.1.1 材料 本实验所用的 狭叶品种 浙贝母鳞茎分别采自浙江省 宁波鄞州区章水镇、龙观乡、鄞江镇 ，金华磐安县 。宽叶浙贝、狭叶浙贝、多籽浙贝三个品种的浙贝母地上茎、叶采自鄞州区章水镇。各对照样品均取自同一采收时间。样品均鉴定无误。 2.1.2 主要化学药品和

18、试剂 表 1 主要化学药品和试剂 试剂类型 规格 生产厂家 PVP 分析纯 江苏永华精细化学品有限公司 -巯基乙醇 分析纯 Sanland-chem International Inc 醋酸钠 分析纯 天津市博迪化工有限公司 CTAB 分析纯 上海展云化工有限公司 EDTA 分析纯 杭州瓶窑和顺化工试剂厂 4 试剂类型 规格 生产厂家 氯化钠 分析纯 无锡市佳妮化工 有限公司 SDS 分析纯 华美生物工程公司 醋酸钾 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 氯仿 分析纯 浙江中星化工试剂有限公司 异戊醇 分析纯 天津市永大化学试剂开发中心 异丙醇 分析纯 金城试剂有限公司 无水乙醇 分析纯 溧阳市光

19、源工贸有限公司 氢氧化钠 分析纯 浙江中星化工试剂有限公司 盐酸 分析纯 浙江中星化工试剂有限公司 醋酸 分析纯 杭州瓶窑和顺化工试剂厂 琼脂糖 分析纯 BIO BASIC INC Tris 分析纯 生工生物工程（上海）有限公司 硼酸 分析纯 国药集团化学试 剂有限公司 2.1.3 主要仪器和设备 表 2 主要仪器和设备 仪器名称 型号 生产厂家 紫外分光光度计 Ultrospec 3300 pro 美国 冰箱 SIEMENS KG24E16TI 国产 台式冷冻离心机 Sigma 3K30 德国 控温高温杀菌箱 Salvis Lab 瑞士 续表 2 仪器名称 型号 生产厂家 电泳仪 EPS 6

20、01 北京市六一仪器厂 电泳槽 DYY-III 型 北京市六一仪器厂 微波炉 Glanz P70D20TP-A3(S0) 格兰仕微波炉电器有限公司 万分之一天平 BS 210 S 北京赛多利斯天平有限公司 恒温水浴锅 Polystat CC3 常州国华设备厂 冷冻离心机 Fresco 德国 5 凝胶成像设备 Gel Doc EQ 美国 立式压力蒸汽灭菌器 YXQ-LS-75 SII 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 移液枪 Eppendorf Research 德国 2.1.4 主要试剂及配制方法 （ 1） Tris-HCl(1M)：称量 121.1gTris 置于 1L 烧杯中，加入 800u

21、L 去离子水充分搅拌溶解，加浓盐酸调节所需 pH 值，定容至 1L 高压灭 菌后，室温保存备用。 （ 2） EDTA（ 0.5M， pH8.0）：称取 186.1gNa2EDTA2H2O 置于 1L 烧杯中，加入约800uL 去离子水充分搅拌，用 NaOH 调节 pH 值至 8.0 时， EDTA 才能完全溶解（约加200gNaOH），加去离子水将溶液定容至 1L，适量分成小份后高压灭菌室温保存备用。 （ 3） TE 缓冲液： 5mL Tris-HCl(1M)， 1mL EDTA（ 0.5M， pH8.0） ,再加 400mL Deionized water 混合，最后定容至 500mL 备用

22、。 （ 4） Marker（现配现用）： 1L DNA Ladder， 1L 6X Loading Dye Solution， 4L Deionized water，混合均匀； （ 5） TBE 缓冲液（ 10）：称取 Tris108g，硼酸 55g， EDTA（ 0.5M， pH=8.0） 40mL，用水定容到 1000mL，作为 10的贮存液。稀释到 10 倍后作为工作液使用； （ 6） 70%乙醇溶液：量取无水乙醇 70mL，然后加去离子蒸馏水 30mL，混合均匀。 （ 7） CTAB 提取缓冲液：称取 CTAB 5g， NaCl 20.455g， Tris-HCl(1M， pH=8.0

23、)25mL，EDTA（ 0.5M， pH=8.0） 10mL，先用 200mL Deionized water 溶解，再定容至 250mL。高压灭菌后，室温保存备用。 （ 8） SDS 提取缓冲液：称取 SDS 1.5g， Tris-HCl(1M)10mL， EDTA（ 0.5M， pH=8.0）10mL,NaCl 2.925g，再加入 70mLDeionized water 溶解（需加热溶解），定容至 100mL 高压灭菌后，室温保存备用。 （ 9）按瓶身标签说明在 Wash Solution 中加入 3 倍体积的无水乙醇，混匀后在瓶身做好标记。于室温密封保存 。每次使用后将瓶盖盖紧，以保持

24、 Wash Solution 中的乙醇含量。若 Wash Solution 由于运输或保管不当造成容量不准，请用量筒定容后再加入相应体积的无水乙醇。 （ 10） PW Solution 在使用前加入 12mL(SK1203)或 24mL(SK1204)的异丙醇。 （ 11） PB Solution 在使用前加入 25mL(SK1203)或 50mL(SK1204)的无水乙醇。 PB Solution 在低温下可能产生沉淀，使用前请检查，如有沉淀，请于 37C 溶解沉淀，待冷6 却至室温后使用。 2.1.5 其他材料 1.5mL 离心管、 1mL;枪头、 200uL 枪头、 10uL;小枪头、

25、100mL 量筒、 500mL 量筒、1000mL 量筒、 100mL 容量瓶、 250mL 容量瓶、 500mL 容量瓶、 100mL 烧杯、 250mL烧杯 100mL 试剂瓶、 250mL 试剂瓶、 500mL 试剂瓶、 1000mL 试剂瓶、 ddH2O、蒸馏水、手术剪刀、一次性手套、一次性橡胶手套、透明胶带、称量纸、擦镜纸、溴酚蓝、溴化乙锭（ EB）。 2.2 方法 2.2.1 材料的处理 叶片的处理：将新鲜叶片洗净擦干后剪碎，放入预冷的研钵中，加入适量的 PVP提取液以及 2%的 -巯基乙醇进行快速研磨。研磨成均匀的糊状后取适量分装入 1.5mL的 Eppendorf管中。 鳞茎的

26、处理： （ 1）将鳞茎去皮洗净后切成细小的状块（冰上进行），放入预冷的研钵中，加入适量的 PVP 提取液以及 2%的 -巯基乙醇进行快速研磨。研磨成均匀的糊状后取适量分装入 1.5mL 的 Eppendorf管中。 （ 2）将鳞茎去皮洗净后烘干，用万能粉碎机研磨成细粉状。用时，称取适量到Eppendorf管中。 2.2.2 浙贝母基因组 DNA 提取方法 2.2.2.1 CTAB 法 CTAB 提取法参照 Dellaporta 等和 Saghai-Maroof等的方法进行，其步骤如下： （ 1）加入 800L预热的 CTAB 提取缓冲液，混匀后 65 水浴 1h， 12000rpm 离心15min； （ 2）取上清，加入等体积的氯仿 /异戊醇（ 24： 1）轻轻混匀， 12000rpm离心 15min，重复此步骤一次； （ 3）取上清，加入 2/3 体积的异丙醇，放入 -20 冰箱 40min，沉淀 DNA； （ 4）加入 200L70%乙醇洗涤 DNA2-3 次 ； （ 5）将 1.5 mLEppendorf 管倒置于通风柜里，使 DNA 尽量干燥； （ 6）加入适量的 TE，溶解 DNA； （ 7）置于 4 冰箱保存，备用。