在酿酒酵母中体细胞杂交：原生质体融合产物的分析[外文翻译].doc

1、 1 本科毕业论文外文翻译 译文： 在酿酒酵母中体细胞杂交：原生质体融合 产物 的分析 来源： Carlsberg Res.Commun.Vol.44.p.225-233,1979 BJORN EGGERT CHRISTENSEN Department of Physiology, Carlsberg Laboratory, Gamle Carlsberg Vej 10, DK-2500 Copenhagen Valby 关键词 ： 酵母 ； 原生质体 ； 聚乙二醇 ； 核融合 ； 四分体分析 将酵母相应的交配类型转变为带有蜗 牛肠道酶的原生质体。在营养要求下聚乙二醇促使融合完成。杂交体总有膜

2、而没有孢子的。不同于非孟德尔遗传标记，不用于筛选，物种的这些标记被发现在亲本和融合子中。两个物种的杂交融合体与另一个两物体的杂交体融合。在孢子形成的二周期和四倍体分析中，假如给所有标记一个常规的分配，那就 表明 那个杂交体细胞的确是交配型的二倍体纯合体。一个独立染色体 出现 分离不是由于 出现 一个异常染色体数目而是一个基因转换或有丝分裂交换 所造成的 。 1 前言 在酵母的生命周期中配对起 到 一个重要的作用，配对和孢子的形成 是 交流和遗传物质分配的正常过程。在 这些过程中 ， 自从大多数酿造酵母被消弱后，杂交育种 就有点难度了 。因为大 多 数酿造种是二倍体或多倍体 ， 诱变育种同样遇到

3、 了困难。 避免酿造种的性无能的一种可能性就是通过原生质体融合的杂交体细胞。原生质体或原生质体 球 就是细胞完整或部分 地 去掉细胞膜。当这个裸露的细胞与活性聚乙二醇表面混合，在两个或两个以上质膜上发生 合并 。这个融合细胞作为原生质体细胞用同样的方法再次生产正常的酵母。如果核配发生， 就会 获得二倍体或多倍体。最后孢子形成或用单体试剂就可以 使之 恢复成原来的染色体数目。 2 表 1 使用酵母种 种类 基因型 来源 C77-D2 A his3 leu2 tup 从 4116e3725c 杂交的孢子 D273-11A A adel his1 关于酵母基因的课程指南 D286-2A A adel

4、 his1 - D517-4B A ade2 lys9 - D585-11C A lys1 - D587-4B A his1 - 3725C A his3 trp - 4116E A leu2 - XXa-I-9 A his4-864ade2-119 trp5a leu2 ilv1 -XXa-III-7 A his4-864 ade2-119 trp5a leu2 - XXa-I-5 A his4-594 ade2-40 trp5b cyh2 lys1 - XXa-I-49 A his-594 ade2-40 trp5b cyh2 lys1 - 酵母通过原生质体融合的体细胞杂交是最值得探索的，

5、他们使用酿酒酵母的标记基因筛选和明确的特性。 酵母 S 的相应交配类型的原生质体内部特别融合被 VAN SOUNGEN、 VAN DER PLAAT , FERENCZY、 MAP,Z 、 YAMAUOaO 和 FUKUI 报道，尽管STEWART是专门报道 S 融合的。酵母属 S，种名，借助于后代的细节分析 GUNGE 和 TAMARU表明两种 S 酵母种原生质体融合可引起一个常规的二倍体纯合子为杂交基因型：融合产物与 aa 二倍体杂交后，合适的染色体遗传标记是根据四倍体分析 得来 的。 目前的学习采用类似的途径。一类是涉及细胞质标记，另一类涉及两种融合，两种类融合并随后杂交和杂交产物的四倍

6、体分析。 2 材料与方法 2.1 生长与媒介 酵母细胞变换成 的 原生质体培养在旋转的振荡器中的 30YPD 液体中： 1%胰蛋白酶酵母提取物， 2%胰 蛋白酶细菌蛋白胨， 2%葡萄糖。在对数期（ 1-3 107个细胞 /毫升）细胞由离心器分离。 3 2.2 种类杂交与基因特点 种类的研究显示在表一中，在种类 XXI-I-49, XXI-I-5,XXa-III-7 和 XXa-I-9中， his4-594 和 his4-864 的补充等位基因分别是 ade2-40 和 ade2-119。携带ade2-40 和 ade-119 的种类分别是红色和粉红色。在 trp5 和 trp5b 之间没有互补

7、。种类 D585-11C, D587-4B, D273-11A 和 D286-2A 被作为交配试验者 。 杂交跟四倍体分析是根据 HAWTHORNE 和 MORTIMER 进行的。孢子形成的媒介是 1%醋酸钾， 0.1%胰蛋白酶酵母提取物， 0.05%葡萄糖，由胰蛋白胨琼脂固定化。染色孔雀石绿 盐基性红色染料常常用于检测孢子 是否 形成。 测试对红霉素跟氯霉素的抵抗性在 YPD 平板上显示（ 3%甘油代替葡萄糖在YPD 中）分别补充 4mg/ml 红霉素和 4mg/ml 氯霉素。 完整合成，介质的营养要求 发现 是 0.67%胰蛋白酶无氨基酸酵母氮源， 2%葡萄糖， 2%胰蛋白琼脂， 是 根据

8、 ZIMMERMANN 描述 进行 适当补充 的 。 2.3 原生质体形成 葡萄糖 从本质上说， 原生质体的形成 基本上 是根据 SCHWENCKE， NEWTON 和FANGMAN 等人 的程序操作的 。收集的细胞在冷水中冲洗两遍， 使 细胞悬浮在预缓冲液中。在实验 3.2 中，缓冲液是由 0.2 M-Tris， 0.02 M-EDTA， 1.2-M 葡己六醇， 0.1M-巯基乙醇 混合而成的 ， PH9.1，在实验 3.3中，预处理在 5 mM-EDTA, 50 mM-二硫苏糖醇 ， 0.1 M-Tris-HC1 和 1 mg/ml 链霉蛋白酶 ,PH8.9 中实施。在30中预处理持续 1

9、5 分钟，随后用 1-M 葡 己六醇和 0.1-M 柠檬酸钠冲洗 3 遍，并调节 PH 值。 在相同介质中，在 30 下用蜗牛肠道酶处理细胞。在试验 3.2 中 Suc dHelix Pomatia 被使用浓度 10%在密度为 3109 个 /ml 的细胞中，持续 90-100 分钟。实验 3.3 中，相关的酶制剂被使用在细胞浓度为 5108 个 /ml，持续 30 分钟。最初，实验 3.2 也被应用到实验 3.3 的种类中，但原生质体形成的非常少且慢（ 200-300分钟）。用离心机收集原生质体，再用山梨醇稳定缓冲液冲洗三遍： 0.67%胰蛋白酶酵母氮基， 1 M-山梨醇， 10 mM-Ca

10、C1。 2.4 融合步骤 融合冲洗后的原生质体是根据 VAN SOLINGEN 和 VAN DER PLAAT 执行的 。慢慢的原生质体颗粒悬浮在 40% w/v 聚乙二醇 4000， 10 mM-CaCl2, 10 4 mMTris-HC1, pH 7.5，细胞的浓度 5107-2108 个 /ml。在 3030 分钟的轻微震荡中悬浮被冲散。在这个时候，几种形式的融合产物在相应的显微镜下可以观察到，包括原生质体的大融合，异核原生质体的巨大融合，几个原生质体融合的单个巨大细胞。用山梨醇缓冲液冲洗三遍 除 去聚乙二醇，并可适当稀释使用。 图 1 融合的流程实验图 2.5 融合原生质体的在再生 把

11、在山梨醇稳定缓冲液中的 0.1ml的融合产物 分别 放置在有或没有补充再生平板上： 0.67%无氨基酸酵母氮源， 1m-山梨醇， 3%的胰蛋白琼脂， 2%葡糖糖。1.5ml 热的 3.2%胰蛋白琼脂从 周围是液体的沸水水浴中取得 1-M 山梨醇，和一个 Drigalski 涂布器，琼脂与融合的原生质体迅速融合，用这个方法固定在几秒钟内完成。一个实际融合实验流程图，三个控制在图像 1 中被介绍。 3 结果 3.1 原生质体有效和再生频率 5 原生质体悬浮，用水洗两遍并 YPD 平板中涂布。只有细胞稳定渗透变成菌落，测量原生质体 的 形成 才能有效进行 。结果显示在表 2,。原生质体的形成效率相当

12、于每个完整细胞的 106 个原生质体或更多。 好的再生要求杂交体细胞的回复效率。表 2 包含了涂布在再生媒介后用聚乙二醇处理的原生质体再生频率。再生频率从 0.03%变化到 20%大概是由于种类的不同和步骤的不同。尤其是蜗牛肠道酶的处理程度是关键。 3.2 涉及细胞质标记的融合 原生质体营养缺陷型 D517-4b 和 C77-D2 混合，用聚乙二醇 4000 处理，再涂布在再生的基本培养基上。两到三天后原生菌落出现（ 表 3）。当亲本分别用聚乙二醇处理并涂布在基本培养基上，没有观察到原生菌落表明用聚乙二醇处理不是菌落出现的原因。同样 D517-4b 和 C77-D2 混合没有用聚乙二醇处理涂布

13、，仍没有菌落出现。正常的融合不是以原生菌落出现为缘由的。没有融合产物产生孢子，那么 就 被认为是杂交型。像亲本之一的 C77-D2,携带抵抗红霉素和氯霉素细胞质基因，融合产物向这些药物靠近的行为被检测到。在表 4 中看到，检测的后代组成了四种可能有两个标记形成的联合体。大概 10%的后代从新组成细胞质标记的。这就说明在杂交时，细胞质标记的分离与 重组 是 相同的方法。 表 2 从不同种类的融合实验中酵母原生质体的再生率 在水中洗涤原生质体并涂布在YPD 中 镶嵌原生质体再生在完全培养基上 种类 原生质体数 菌落数 原生质体数 菌落数 融合率 C77-D2 D517-4B XXI-I-49 XX

14、I-I-5 XXa-III-7 XXa-I-9 41017 41016 11016 11016 11016 11016 0 1 0 0 0 0 2.5103 8102 3107 2107 3105 2107 5102 84 104 104 300 104 20 10.5 0.03 0.05 0.1 0.05 6 表 3 涉及细胞质标记的融合实验 D517-4B C77-D2 D517-4B+ C77-D2 聚乙二醇处理 原生质体涂布在基本培养基上 4.7107 1.7107 1.2107 1.2107 2108 2108 菌落数 0 0 0 156 3.3 his4 和 ade2 融合补充类型

15、 两个杂交类型 XXI-I-49 a his4-594 ade2-40 trp 5b cyh2 lys1 和 XXa-I-9 a his4-864 ade2-119 trp5a leu2 ilv1 融合。两个 his4 突变体基因和两个 ade2 突变体基因补充到杂交体细胞中，通过涂布在补充有色氨酸的基本培养基 中进行 筛选。 同样的，两个杂交类型 XXa-I-5 A his4-594 ade2-40 trp5b cyh2 lys1 和XXa-III-7 A his4-864 ade2-119 trp5a leu2 杂交。 表 5 表明，几百个菌落获得在没有控制的实验情况下引起菌落 。 自从

16、用相反的交配型交配后只能产生孢 子 ， 244 个测试融合体 就 发现交配类型都是纯合子。 3.4 从补充型 his4 和 ade2 融合产物分析基因 根据数据 2 实行了混合体细胞的基因分析：在两个融合产物交配后四分体被传播和产生孢子。一个子囊被分解，一个二倍体孢子生长并测试它们生成孢子的能力。只有 aa 基因型有产生孢子的能力。 用这个方法可以筛选出已经产生四个 aa 克隆体的四分体。从这些包含单倍体孢子的克隆体中取出孢子，一一分析，被分析为营养缺陷型和抵抗放线菌。从这些四分体中，采用分析二倍体孢子的基因型，被放置在表 4 中 作 为两队融合产物。在第一次试验中所有可测试 的标记分离都被获

17、得，证明交配型的确是一个四倍体包含所有亲本染色体 XXI-I-5， XXI-I-49， XXa-I-9 和 XXa-III-7 而且融合产物的二倍体。 在第二个试验中也被观察到所有标记完整的分离，除了 leucine2 基因被观察到是 6:2 而不是 4:4 分离，这个例外分离必须是由于一个基因转换或一个有丝分裂交换，而不是染色体 III 的非正倍性。 7 表 4 抵抗红霉素氯霉素的 152 杂交产物 EPYSCAPS ERYRCAPS ERYSCAPR ERYRCAPR 菌落数 72 7 10 63 表 5 通过 酵母体携带营养缺陷补充基因的原生质体融合的杂交体细胞 XXI-I-49 XXI

18、-I-5 XXa-III-7 XXa-I-9 XXI-I-49+ XXa-I-9 XXI-I-5+ XXa-III-7 聚乙二醇处理 + + + + - + - + 涂布在补充有色氨酸的基本培养基上 4107 2107 3107 7107 2107+3107 5107 +8107 1107 +2107 3107 +5107 菌落数 0 0 0 0 0 800 0 714 4 讨论 完整的交配型酵 母细胞不会交换遗传物质，但是当两种有着完全相同交配型的不同营养缺陷型的菌株的原生质体混合物被聚乙烯乙二醇处理，产生了重组细胞，这些细胞弥补了彼此的不足。 表三和表五的数据给了我们一个统计的论据：原养型

19、微生物实际上是有性生殖的：野生型的菌落的出现并不是因为父类菌株中的标记的恢复；因为在这种情况下，每个被聚乙烯乙二醇处理过的父类菌株已经给自己的后代一个特定的再生培养基。同样地，在嫁接着未被聚乙烯乙二醇处理过的父类菌株的再生板上，如果没有菌落的产生，那么交配的可能性就被排除。 然而，比统计参数更重要的就是产物的遗 传分析：存在于聚乙烯乙二醇中的物质可能在交配类地点发生了诱变的作用，使得细胞能够交配，也就意味着孢子的产生，但是这一现象没有出现。此外，四分染色体中交配型等位基因的隔离也如预期的那样，比例为 4:4。 8 图 2 在表 5 跟表 6 中介绍的融合产物的遗传分析步骤图表 如果融合产品被认

20、为是二倍体，那么与之相反的交配型交配产生的融合产品将会变成四倍体。当 a/a/ 细胞被诱导进行孢子生殖时，就会出现三种类型的二倍体孢子， a/a 和 / 孢子不会进行孢子生殖，而 a/ 在诱导下会发生减数分裂。在四个孢子都为 a/(17)的 情况下，四分体出现得很频繁。 这样两个四分体通过孢子形成和四分体分析受到近一步的分解。除了一个以2:6 的分离成预期比率以外，其他所有的以 4:4 的比率分离。由于在同一个染色体上的交配型对数基因有规律地分离，第二个四分染色体中基数分离的 leu2 必须取决于基因转换或者体细胞交换，而且呈非整倍性。 来自融合物 C77-D2 的产物带有 ERYRCPR和

21、D517-4B，它被期望能抵抗霉素和氯霉素。事实上，抵抗这些药物的重组体 ERYSCAPR和 ERYRCAPS的测试发现证实了融合物得假设。 相信非整倍性发生在任何 一个没有标记的染色体上的原因既不是在 Gunge9 和 Tamaru 的研究里，也不是当前的研究。 可以 推断， a+a 融合物 和 + 融合物都 能够为交配型基因提供有规律的纯合子的二倍体。 表 5 数据 2 通过步骤分析两对原生质的的基因 期待的融合产物基因： 致谢 感谢 DITER YON WETTSTEIN, Dr.MORTEN KIELLAND-BRANDT, Dr. TORSTEN NILSSoN-TILLGREN 的

22、鼓励与他们之间有意义的讨论。 STEEN HOLMBERG 和 Dipl.Biol. BARBARA WILKEN 非常欣赏。 10 参考文献 1. Course manual on yeast genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1974) 2. EDDY, A. A. & D. H. WILLIAMSON: A method of isolating protoplasts from yeast. Nature 179,1252-1253 (1957) 3. EMEIS, C. C.: Haploidisierung yon diploiden

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