藻毒素复合污染对鱼体的免疫毒性研究【开题报告】.doc

1、毕业论文开题报告 环境科学 藻毒素复合污染对鱼体的免疫毒性研究 一、选题的背景和意义 1. 选题背景 湖泊富营养化导致的蓝藻水华已成为国内外普遍关注的环境问题，它所带来的主要危害之一是产生的藻毒素对鱼类的影响。在已发现的藻毒素中，微囊藻毒素（ MCs)的分布广、毒性大、危害严重，而备受关注。阐述了 MCs 对鱼类的影响。微囊藻毒素能干扰胚胎的发育，降低孵化率，增加畸形率，影响存活率，胚胎孵化受微囊藻毒素影响还具有剂量依赖效应；野外室内实验均表明鱼类暴露于微囊藻毒素后不仅可在肝脏中富集还可在肌肉、肠道等组 织器官中快速积累；对鱼类进行组织病理检测发现 MCs可导致肝脏、肾脏、心脏、脑、鳃等组织受

2、损；MCs 在鱼体中的解毒过程可能开始于由谷胱甘肽 S-转移酶催化的还原型谷胱甘肽的结合反应； MCs 还可影响鱼类的生长、行为和血清生化指标，此外，还具有一定的免疫毒性。 2. 选题意义 通过比较 两种不同的 MCs 对 鱼的 毒效应及 鱼 不同组织对 MCs 生化响应的差异，探讨并归纳 MCs 的转运机制和分子作用机制以及在食物链中传递过程中对人类造成的潜在影响。 为探讨 MCs 的致毒机理 以及对人体的危害 提供进一步的参考依据。 二、研究目标与主 要内容 1.研究目标 两种典型微囊藻毒素 MCLR 和 MCRR 体外低剂量复合条件下对鱼体的免疫毒性影响。 2.主要内容 （ 1）藻毒素

3、MCLR 单一作用下对鱼体免疫细胞毒性； （ 2）藻毒素 MCRR 单一作用下对鱼体免疫细胞毒性； （ 3）不同浓 度 MCLR 和 MCRR 复合作用下对鱼体免疫细胞毒性； 三、拟采取的研究方法、研究手段及技术路线、实验方案等 1.1 研究对象 质量为一斤左右的鲫鱼若干，在实验室驯养一段时间之后，使得鱼的一般性状都基本相同之后才作为被研究的对象。 1.2 实验方法 取鲫鱼体中主要免疫器官 肾脏和脾脏，剪碎之后，作为样品采集。 25mL 烧杯装一定量的 PBS 待用，用酒精棉将鱼体消毒。从排泄口至胸鳍，然后沿胸鳍及排泄口垂直剪至背部，将鱼肚沿剪切线向外翻，观察到内脏里有两条暗红色组织即脾脏。小

4、心用弯头镊子取出至 PBS 中，取完之后用镊子弯头处将内脏拉至肚子外面会在背部发现两块对称的有薄膜包背的组织，即肾脏。小心取用手术剪剪断连着的线，至此，杀鱼取脏步骤完成。 1.3 样品的实验室制备 （ 1）用 PBS 漂洗至溶液基本透明，烧去多余的血及杂质。 （ 2）用手术剪将取出物剪碎，剪 5min 以上，剪成匀浆状。 （ 3） 用 100 目不锈钢网筛过滤至小烧杯中 50mL， 将 25 mL 润洗后一并倒入至 64 mL 左右分离液。 （ 4）取 16 根无菌试管，分别加入 4 mL 淋巴细胞分离液，然后沿试管壁小心慢慢加入 4 mL 细胞悬液（混匀）必须保证溶液的上下分层。加的时候要越

5、慢越好。 （ 5）离心设定： 4000r min-1，离心 20min。 （ 6）小心仔细吸收交界处呈乳白状云雾层鱼新试管中，再次离心 5min，去除上清液。 （ 7）取适量于 Nikon 显微镜下计数，结果每小格 =6 个 ，细胞密度为6 400 104. （ 8）将细胞接种于 24 孔板，密度为 1.8 106 个 / mL /孔， 14 孔于 27 培养箱中培养待用。（ 1mL） （ 9）取 MCCR 20mg/L，配置 1 g/L， 10 g/L， 50 g/L， 100 g/L， 500g/L， 1000 g/L 处理，诱导 12 小时，准备 2 个平行样。 （ 10） 12 小时后

6、，小心将培养液 离心（ 2000r,10min)弃上清液。（为避免失败，取 31 电泳，后备用） 1.4 DNA 损伤实验研究方法 取 3.2.2 中步骤 6 淋巴细胞（ 106cell/mL）用受试毒素（ 3.1.2）处理 12h 后，用爱思进公司 DNA 小量提取试剂盒提取淋巴细胞 DNA，运用琼脂糖凝胶电泳法：制 0.8%琼脂糖凝胶，后按溴酚蓝： DNA 1:1 加样， 110V，电泳 30min 后 EB 染色，观察，分析毒素对 DNA 损伤情况。 1.5 分析检测方法 1.5.1 运 用细胞活性 MTT 检测法，对毒素作用下淋巴细胞的存活率进行检测。 1.5.2 运用透射电镜观察毒素

7、作用下，鱼体淋巴细胞的凋亡情况。 1.5.3 运用琼脂糖凝胶电泳技术检测藻毒素对淋巴细胞 DNA 的损伤情况。 四、参考文献 1World Health Organization. Algae and cyanobacteria in fresh water Guidelines for safe recreational water environments,Vol 1. coastal and freshwaters. Geneva,Switzerland,2003: 136-158. 2 Dittmann E,Neilan B A,Borner T. Insertional mutage

8、nesis of a peptide synthetase gene that is responsible for hepatotoxin production in thecyanobacterium Microcystis aeruginosa PCC7806. Molecular Microbiology,1997,26(4): 779-787. 3 Kleikauf H,Von Dohren H. A non-ribosomal system of peptide biosyntheses. European Journal of Biochemistry,1996,236(2):

9、335-351. 4 Hoeger S J,Hitzfeld B C,Dietrich D R. Occurrence and elimination of cyanobacterial toxins in drinking water treatment plants. Toxicology andApplied Pharmacology,2005,203(3): 231-242. 5 Kenneth M,Mackenthun,Herman E F. A heavy mortality of fishes resulted from the decomposition of algae in

10、 the Yahava River,Wilsconson.Transactions of the American Fisheries Society,1945,75(1): 175-180. 五、研究的整体方案与工作进度安排 （内容、步骤、时间） 1、 2010.1.1-2011.2.20 鱼体免疫细胞体外分离实验 完成样品的分层采集工作，在实验室内开展鲜样的前处理及保存，分析测定pH 值和含水率等理化参数。 2、 2011.2.20-2011.3.15 细胞毒性测试实验 两种典型微囊藻毒素 MCLR 和 MCRR 体外低剂量复合条件下对鱼体免疫毒性影响。 3、 2011.3.15-2011.3.30 结论及论文初稿撰写 研 究实验结果，给出实验结论 ,撰写论文初稿 . 六、研究的主要特点及创新点 （ 1）从微观的分子角度及其超微结构观察探讨藻毒素对鲫鱼淋巴细胞的毒性损伤，能够更加完整的阐述毒素机理。 （ 2）不同浓度 MCLR 和 MCRR 复合作用下对鱼体免疫细胞毒性。 （ 3）毒素在食物链中的积累及对人体的潜在危害研究。