2,4´-二羟基-3´-甲氧基-4-异戊烯氧基查尔酮化合物合成及抗抑郁作用研究【毕业论文】.doc

1、毕业论文 文客久久 本科 毕业论文 (设计 ) 题 目： 2， 4-二羟基 -3-甲氧基 -4-异戊烯氧基查尔酮化合物合成及抗抑郁作用研究 学 院： 学生姓名： 专 业： 药学 班 级： 指导教师： 起 止 日期： 1 2， 4-二羟基 -3-甲氧基 -4-异戊烯氧基查尔酮化合物合成及抗抑郁作用研究 摘要 目的： 为了 寻找到抗抑郁活性好 、 毒副作用 较 低的化合物 ， 我们以 Butein 为 先导化合物，对其进行结构修饰，设计合成了 2， 4-二羟基 -3-甲氧基 -4-异戊烯氧基 化合物 。方法 ：本文 以 2,4-二羟基苯乙酮为起始原料， 设计两种路线合成 2， 4-二羟基 -3-甲

2、氧基 -4-异戊烯氧基查尔酮化合物， 对目标化合物采取 小鼠强迫游泳实验 进行抗抑郁活性筛选 。结果：采用红外光谱、核磁共振氢谱和质谱确确定了其化学结构 。药理实验结果显示， 2， 4-二羟基 -3-甲氧基 -4-异戊烯氧基查尔酮化合物 有抗抑郁活性 (p0.01)。结论： 目标化合物的 合成采用方法 （一）比 方法 （二）简单、产率高，产物易分离。 关键词 ： 2， 4-二羟基 -3-甲氧基 -4-异戊希氧基查尔酮化合物；抗抑郁；合成 2 Synthesis and evaluation of 2， 4-double hydroxyl-3-methoxy-4-prenylation oxge

3、n Chalcone as a new antidepressant effects of compounds Abstract Objective: To look for strong antidepressant effect, higher toxicity of the new antidepressant drugs. This article is designed to Butein as a leading compound and its structural transformation, the closed loop to form 2,4-double hydrox

4、yl-3-methoxy-4-prenylation oxgen Chalcone.Methods: This article is designed two methods to get the compound 2， 4-double hydroxyl-3-methoxy-4-prenylation oxgen Chalcone from 2,4 - two hydroxyl acetophenone as starting material, the use of IR H NMR and MS spectroscopy to determine its chemical structu

5、re and activity of the antidepressant . Pharmacological antidepressant activity by forced swimming test in mice. Results: IR H NMR and MS to determine its chemical structure. Forced swimming test in mice show that the 2， 4-double hydroxyl-3-methoxy-4-prenylation oxgen Chalcone compound have antidepr

6、essant activity. Conclusion: The first synthetic route is more simple and has higher yield than the second synthetic route Key words 2， 4-double hydroxyl-3-methoxy-4-prenylation oxgen Chalcone ; synthesis； antidepressant effects; 3 1. 前言 抑郁症是躁狂抑郁症的一种发作形式 ,是由各种原因引起的以 抑郁 为主要症状的一组 心境障碍 （ mood disorders

7、）或情感性障碍（ affective disorders）。 以情感低落、思维迟缓、缺乏自信、以及言语动作减少 ,迟缓为典型症状。具有高 患病率、高复发率、高致残率和高致死率等特点，被称为 第一心理杀手 。抑郁症严重会造成患者的身体上和精神上的沉重负担，最终死于自杀。 预计到 2020 抑郁症已经成为中国疾病负担的第二大 疾 病 1-2。 但抑郁药物也面临着市场发展难题， 开发疗效更高、不良反应更少的新型抗抑郁药将成为制药研发者所共同奋斗的目标。目前，我国主要的抑郁药物是化学药物治疗，但其副作用多。因此，国内外研发者将目标转移到传统药物和天然药物 2-3。天然查尔酮类化合物属于黄酮类化合物，由

8、于其生理活性多种多样，如抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗溃疡和解痉等 生物活性 3-5。近年来 , 引起了国内外的广泛重视，研究进展很快。陆续有报道表明，黄酮类化合物具有抗抑郁活性6。鉴于此，本实验合成了 2， 4-二羟基 -3-甲氧基 -4-异戊希氧基查尔酮化合物 ， 通过利用经典抗抑郁模型 -小鼠强迫游泳实验对该化合物进行抗抑郁活性初步筛选。 1.1 概述 1.1.1 2， 4-二羟基 -3甲氧基 -4 异戊烯氧基查尔酮化合物 查尔酮，又名二苯基丙烯酮， 其中天然查尔酮类化合物的生理活性多种多样，主要存在于甘草、红花等药用植物中，由于其分子结构具有较大的柔性，能与不同的受体结合 7-8。大量科学研

9、究表明 ,其有抗蛲虫作用、抗过敏性作用、预防和抗肿瘤活性。同时它也作为抗生素、抗疟疾的药物成分。 近年来，陆续有报道表明黄酮类化合物在其抗抑郁有效成分中发挥着非常重要的作用 9-10。 有文献报道查尔酮还有抗抑郁作用，而异戊烯基取代羟基，可以提高其药理活性。 查尔酮是一类重要的有机合成中间体，有多个反应活性中心，在迈克尔加成反应和光反应中具有广范的应用。 2， 4-二羟基 -3-甲氧基 -4-异戊希氧基查尔酮化合物属于黄酮类化合物。 具有 C6-C3-C6 基本构型，为植物体多酚类代谢物。鉴于此，本实验 合成 2， 4-二羟基-3-甲氧基 -4 -异戊烯氧基查尔酮化合物， 通过利用经典抗抑郁模

10、型 小鼠强迫游泳实验对该化合物进行抗抑郁活性初步筛选 11。 为了找到抗抑郁活性好，合成路线简便，产率高的化合物，以化合物 为先导化合物，对其进行结构优化，在 的 B 环上的 3 位引入甲氧基，设计成 2， 4-二羟基 -3-甲氧基 -4-异戊烯氧基查尔酮。 本文研究设计合成的目标化合物，均为未见文献报道的新化合物，结构经红外光谱、核磁共振氢谱及质谱确证。通过利用经典抗抑郁模型 小鼠强迫游泳实验对该化合物进行抗抑郁活性验证。 OO HH O O H （先导化合物） 4 OH OO HR查尔酮的： R=4-羟基 -3-甲氧基 OO RO H 异戊烯基取代的查尔酮 1.1.2 抗抑郁药 -氟西汀

11、氟西汀 (Fluoxetine)是一种 选择性血清再吸收抑制剂 (SSRI)的新 型抗抑郁药。其商品名 :百优解、优克，药物形态为盐酸氟西汀（ Fluoxetine hydrochloride）。其作用机制是 能有效地抑制神经元从突触间隙中摄取 5-羟色胺，增加间隙中可供实际利用的这种神经递质，从而改善情感状态，治疗抑郁性精神障碍 12。 临床上用于成人抑郁症、神经性贪食症和 强迫症的治疗，还用于治疗具有或不具有广场恐惧症的惊恐症。 目前临床使用的抗抑郁药主要有以下五大类 构成：单胺氧化酶抑制剂 (MAOI)、三环类抗抑郁药、五羟色胺（ 5-HT）再摄取抑制剂、多巴胺摄取抑制剂和选择性去肾上腺

12、素（ NA）再摄取抑制剂 13。选择性 5-TH 再摄取抑制剂的代表药物是被称为抗抑郁 五朵金花 的氟西汀 (fluox-etine)、帕罗西汀 (paroxetine)、舍曲林 (sertra-line)、西酞普兰 (citalopr-am)、氟伏沙明(fluvoxam-ine)等 5 种。选择性 5-HT 再摄取抑制剂 (SSRI)具体不良反应：有增加青少年焦虑、自杀观念和自伤行为的不良反应。由于长期服用这些 化学合成药物，对人体产生严重的不良反应，影响生活质量，不得不停药控制症状 14。因此开发作用选择性强，不良反应少的新型抗抑郁药将成为制药研发者所共同奋斗的目标。 因此，本实验以氟西汀

13、作为对照来比较新合成化合物的抗抑郁活性，从结果看出，运用 Jandel Scient if ic: Sigma Stat 2. 0 统计软件进行方差分析和 t检验 , 得出化合物 2， 4-二羟基-3-甲氧基 -4-异戊烯氧基查尔酮 p0.01, 表明此合成化合物有抗抑郁活性。 2 实验材料、主要试剂与仪器 2.1 实验材料 : 2.1.1 动物昆明雄性小鼠 :体质量 (22 2) g，由延边大学医学部实验动物科提供，在 25 条件下饲养，实验前稳定 3 天，自由进食饮水。 2.1.2 药物阳性对照药 :盐酸氟西汀 (美国 Lilly 公司 )，由延边大学药学院提供的 7 个查尔酮类化合物，经

14、红外光谱、 1H NMRR 和 MS 确证结构，与参考文献一致。 5 2.2 实验仪器 仪器名称 型号 厂家 精密天平 BS323S 赛多利斯科学仪器 有限公司 旋转蒸发仪 RE-2000 上海亚荣生化仪器厂 电热恒温鼓风干燥箱 DHG-9023A 上海 亚荣生化仪器厂 恒温水浴 锅 HH-S 巩义市予华仪器责任有限公司 磁力搅拌器 85-2 常州国华电器有限公司 硅胶预制板 H 国药集团化学试剂有限公司 调压器 TOGC2-3 环宇集团有限公司 循环水式多用真空泵 SHB-IIIA 河南省太康科教器材厂 核磁共振仪 BRUKER AV-300 上海精密科技有限公司 质谱仪 API2000 上

15、海精密科技有限公司 红外光谱仪 FI21730 2.3 实验试剂 试剂（规格） 厂家 丙酮（分析纯 AP） 国药集团化学试剂有限公司 碳酸钾（分析纯 A.R） 国药集团化学试剂有限公司 石油醚（分析纯 A.R） 国药集团化学试剂有限公司 乙酸乙酯（分析纯 A.R） 国药集团化学试剂有限公司 无水碳酸钠（分析 纯 A.R） 宁波市化学试剂厂 无水乙醇（分析纯 A.R） 国药集团化学试剂有限公司 95%乙醇（分析纯 A.R） 国药集团化学试剂有限公司 溴代异戊烯（分析纯 A.R） 国药集团化学试剂有限公司 乙醚（分析纯 A.R） 国药集团化学试剂有限公司 甲醇（分析纯 A.R） 国药集团化学试剂有

16、限公司 氯甲基甲醚（分析纯 A.R） 国药集团化学试剂有限公司 氢氧化钾（分析纯 A.R） 国药集团化学试剂有限公司 浓盐酸（分析纯 A.R） 国药集团化学试剂有限公司 二甲基硅油（分析纯 A.R） 阿拉丁化学试剂有限公司 氯化钙（分析纯 A.R） 中国泗联化工厂 柱层层析硅胶 100200 目（分析纯 A.R） 青岛海洋化工厂分厂 蒸馏水（分析纯 A.R） 自备 2,4, -二羟基苯乙酮（分析纯 A.R） 国药集团化学试剂有限公司 6 3-羟 -4-甲氧基苯甲醛 国药集团化学试剂有限公司 3 实验方法与结果 3.1 合成路线 方法一： 2， 4-二羟基 -3-甲氧基 -4-异戊烯氧基查尔酮化

17、合物合成路线 (一 ) 15-17 OH OB rK 2 C O 3 丙 酮OOK O H E t O H/O HO HC H OO C H 3O HOO O HO HO C H 3方法 二： 2， 4-二羟基 -3-甲氧基 -4-异戊烯氧基查尔酮化合物合成路线 (二 ) 17-20 OH OO HC l C H 2 O C H 3K 2 C O 3 丙 酮/OO HM O M OK O H E t O H/C H OO C H 3O HOO HM O M OO HO C H 3B rK 2 C O 3 丙 酮/OO O HO HO C H 3H C lOO HH OO HO C H 33.1

18、.1 2， 4-二羟基 -3-甲氧基 -4-异戊烯氧基查尔酮化合物合成路线 (一 ) 3.1.1.1 2-羟基 -4-异戊烯氧基苯乙酮的合成 将 2.0g2， 4-二羟基苯乙酮， 3.81g（无水 K2CO3 于 100ml 圆底烧瓶中，加入适量的无水丙酮，在油浴中加热至 50 ，剧烈搅拌混匀。反应回流一个小时后，取 1.98mlC5H9 Br 混溶于 5ml 无水丙酮中，慢慢地滴加入反应 中。 4h 内回流反应，直至 TLC 监测反应到原料点消失，停止反应。过滤，用少量丙酮冲洗残渣。以石油醚 /乙酸乙酯 /V(石油醚） /V（乙酸乙酯） =10:1 柱层析，得淡黄色油状液体 2-羟基 -4-

19、异戊希氧基苯乙酮 2.8g，产率 70%。 3.1.1.2 2， 4-二羟基 -3-甲氧基 -4-异戊烯氧基查尔酮的合成 在 100ml 圆底烧瓶中加入 2.2g2-羟基 -4-异戊烯氧基苯乙酮， 1.73g3-甲氧基 -4-羟基苯甲7 醛，在搅拌下缓慢滴加由 124.1ml 无水乙醇和 13.8gKOH 配成的溶液（ 14%），室温下搅拌反应。搅拌 24h，析出大量黄色固体， TCL 监测反应到出现黄色荧光点并原料点消失，停止反应。将产物倒入冰水中，加 5mol/L HCl 调 PH 至中性，抽滤，得黄色固体物质，用 95%乙醇重结晶，得到黄色针状结晶 2， 4-二羟基 -3甲氧基 -4 异

20、戊希氧基查尔酮 2.23g，产率为 62%。 mp 104-105 ; yield = 62 %; 1H-NMR(CCl3D) ： 1.67(s， 3H， -CH3)， 1.72(s， 3H， -CH3)， 2.47(s，3H， -OCH3)， 4.47(d， 2H， -CH2)， 5.40（ t， 1H， =CH） ， 6.377.82（ m， 3H,-C6H3） ， 7.78(d，1H， J=9 Hz， =CH)， 6.387.74(m， 4H， -C6H4)， 7.81(d， 1H， J=9 Hz， =CH)， 12.67（ s，1H， -OH） , 12.77（ s， 1H， -OH）

21、 ;IR (KBr) cm : 3329 (OH), 1670(C=O); C20H20O5. MS m/z 341 (M + 1). 3.1.2 2， 4-二羟基 -3-甲氧基 -4-异戊烯氧基查尔酮化合物合成路线 (二 ) 3.1.2.1 2-羟基 -4-甲氧基苯乙 酮的合成 将 5.0g（ 32.9mmol） 2， 4-二羟基苯乙酮， 9.5g(68.8mmol)无水 K2CO3 于 100ml 圆底烧瓶中，加入适量的无水丙酮，在油锅中加热至 50 ，剧烈搅拌混匀。反应回流一个小时后，取 6.5ml（ 85.5mmol） ClCH2OCH3 混溶于 5ml 无水丙酮中，缓慢加入反应中。直

22、至 TLC 监测反应到原料点消失后，停止反应。反应进行 4h。过滤，用少量丙酮冲洗残渣。以石油醚 /乙酸乙酯 /V(石油醚） /V（乙酸乙酯） =10:1 柱层析，得谈黄色油状液体 2-羟基 -4-甲氧基苯乙酮 5.2g，产率 80%。 3.1.2.2 2， 4-二羟基 -3-甲氧基 -4-甲氧甲氧基查尔酮的合成 在氮气流保护下，将 1.0g（ 5.10mmol） 2-羟基 -4-甲氧基苯乙酮， 0.89g（ 5.63mmol） 3-甲氧基 -4-羟基苯甲醛于 100ml 圆底烧瓶中，搅拌时缓慢滴加由 4.8gKOHg 和 43.6mlEtOH 配成的溶液（ 14%），室温下反应，室温搅拌 3

23、0h，析出大量黄色固体。直至 TLC 监测反应到原料点消失后，停止反应。抽滤，得黄色固体物质，用少量水洗涤后，用 95%乙醇重结晶得到黄色针状结晶 2， 4-二羟基 -3-甲氧基 -4-甲 氧甲氧基查尔酮 1.20g，产率 70%。 3.1.2.3 2， 4,4 -三羟基 -3-甲氧基查尔酮的合成 取 1.0g（ 2.98mmol） 2， 4-二羟基 -3-甲氧基 -4-甲氧甲氧基查尔酮于 50ml 圆底烧瓶中，溶于极少量的甲醇中，回流溶解后，缓慢滴加 5mol/LHCl 25ml 进行脱保护，反应 10h 后，TLC 跟踪反应直到原料点消失，停止反应。进行处理反应，用乙醚萃取，乙醚层加无水硫

24、酸镁干燥，抽滤旋干，以石油醚 /乙酸乙酯 /V(石油醚） /V（乙酸乙酯） =10:1 柱层析，得深黄色针状结晶，干燥后乙醇重结晶得 2， 4,4-三 羟基 -3-甲氧基查尔酮 0.55g，产率 62% 3.1.2.4 2， 4-二羟基 -3-甲氧基 -4-异戊烯氧基查尔酮的合成 取 0.5g（ 1.75mmol） 2， 4,4-三羟基 -3-甲氧基查尔酮， 0.48g(3.48mmol) 无水 K2CO3于圆底烧瓶中，加入适量丙酮，在油浴中加热至 50 ，搅拌反应一个小时后，取 0.24ml（ 2.08mmol） C5H9 Br 混溶于 5ml 丙酮中，缓慢地加入反应中。反应 10h 后，

25、TLC 跟踪反应直到原料点消失，停止反应。，进行处理反应，过滤 K2CO3，用少量无水丙酮洗涤滤渣。旋干，用 300-400 目的硅胶干法上柱，以石油醚 /乙酸乙酯 /V(石油醚） /V（乙酸乙酯） =30:1柱层析，得黄色针状结晶， 95%乙醇重结晶得到 2， 4-二羟基 -3-甲氧基 -4-异戊希氧基查尔酮 0.21g，产率 33%。 mp 104-105 ; yield = 33%; 1H-NMR(CCl3D) ： 1.67(s， 3H， -CH3)，8 1.72(s， 3H， -CH3)， 2.47(s， 3H， -OCH3)， 4.47(d， 2H， -CH2)， 5.40（ t，

26、1H， =CH） ， 6.377.82（ m， 3H,-C6H3） ， 7.78(d， 1H， J=9 Hz， =CH)， 6.387.74(m， 4H， -C6H4)， 7.81(d， 1H，J=9 Hz， =CH)， 12.67（ s， 1H， -OH） , 12.77（ s， 1H， -OH） ;IR (KBr) cm : 3329 (OH), 1670(C=O); C20H20O5. MS m/z 341 (M + 1). 3.2 抗抑郁药理实验：小鼠强迫有用实验 小鼠强迫游泳实验：参见（ Porsolt RD et al, Arch Int Pharmaeodyn Ther,1977

27、）等报道 21的方法，将合成化合物和 氟西汀给药剂量均为 10mg/kg，腹腔注射给药 30 分钟后，将小鼠放入 XSC小鼠恒温游泳仪内 (水深 10cm、直径 35cm 的桶内，水温 252oC)，每做完一次后换水，观察 6 分钟内小鼠游泳情况，统计小鼠后 4 分钟内游泳累积不动时间 (不动即小鼠停止挣扎或小鼠呈漂浮状态，小鼠四肢有轻微动作以保持头部在水面 )，与模型组比较。 4 实验结果 4.1 药理实验结果 Table 1: Antidepressant activities of the compounds Compounds R Dose (mg/kg) Antidepressant

28、 activities Duration of immobility (s)(meanS.E.M.) - 10 99.315.1* 3-OCH3-4-OH 10 81.515.2* Fluoxetine 10 57.48.9* Control 141.510.9 Values represent the mean S.E.M. (n = 10). *Significantly compared to control (Dunnets test: *p 0.05, *p 0.01， *p 0.001) 表 1：小鼠强迫游泳实验结果 4.1.2.3 由上图可知 2， 4-二羟基 -3-甲氧基 -4

29、-异戊烯氧基查尔酮化合物 与模型组相比的 p 值小于 0.01，由此初步断定该化合物具有抗抑郁活性。 5 讨论 5.1 讨论 两 步走合成路线 5.1.1 2-羟基 -4-异戊烯氧基苯乙酮的合成反应属于酚的取代反应，在 K2CO3 溶液形成的碱性条件下，酚羟基解离成酚盐负离子，与溴代异戊希基发生亲核取代反应，可以保 护羟基。但是 2 位羟基没有发生取代，因为 2 位羟基与邻位羰基形成分子内氢键，比较稳定，不容易被取代。由于溴代异戊烯活性强，因此该步骤反应时间较短，产率较高，为 85% 5.1.2 2， 4-二羟基 -3-甲氧基 -4-异戊烯氧基查尔酮的合成反应属于醛酮的定向缩合反应（ orie

30、ntation aldol condensation），在 14%KOH 碱性条件下，无 氢的 4溴苯甲醛提供羰基9 和具有取代基的含 氢的苯乙酮提供烯醇负离子进行混合缩合反应。要求溶液的碱性不能太强，也不能太弱。如果碱性过强，则苯甲醛发生分子间氧化 还原。如果碱性过弱，则不利于产物失水完全，会以加成物的形式出现。此外，苯甲醛自身发生加成反应，影响产率。该步骤反应剧烈，反应时间需较长，为 24h，反应过程严格控制碱性强度、加热温度、加热时间，产率较高。 5.2 讨论四步走合成路线 5.2.1 2-羟基 -4-甲氧基苯乙酮的合成反应属于酚羟基的成醚反应，在 K2CO3 溶液形成的碱性条件下，酚羟

31、基解离成酚盐负离子，与氯甲基甲醚发生亲核取代反应，保护羟基，使之在下面的反应中不被其他基团取代，但是 2 位羟基没有发生取代，因为 2 位羟基与羰基形成分子内氢键，比较稳定 ，不容易被取代。由于氯甲基甲醚的活性较强，因此该步骤反应时间较短，产率较高，为 82%。 5.2.2 2， 4-二羟基 -3-甲氧基 -4-甲氧甲氧基查尔酮的合成反应属于醛酮的定向缩合反应（ orientation aldol condensation），在 14%KOH 碱性条件下，无 氢的 4溴苯甲醛提供羰基和具有取代基的含 氢的苯乙酮提供烯醇负离子进行混合缩合反应。要求溶液的碱性不能太强，也不能太弱。如果碱性过强，则

32、苯甲醛发生分子间氧化还原。如果碱性过弱，则不利于产物失水完全，会以加成物的形式出现。此外， 苯甲醛自身发生加成反应，影响产率。该步骤反应剧烈，反应时间需较长，反应过程严格控制碱性强度、加热温度、加热时间，产率较高。 5.2.3 2， 4,4-三羟基 -3-甲氧基查尔酮的合成反应属于典型的醚水解反应，在强酸催化条件下，水解产物为 2， 4,4-三羟基 -3甲氧基查尔酮。在第一步反应中，氯甲基甲醚与先导化合物成醚，是为了保护 4 位的酚羟基，并且由于分子内氢键，使得 2 位酚羟基不受影响，继续反应。为了在 4 位酚羟基上取代溴代异戊烯基，须先使酚羟基重现，在第二步反应完成后，需要在此步骤脱去保护，

33、得到产物 2， 4,4-三羟基 -3甲氧基查尔酮。由于盐酸具有挥发性，在加热过程中， HCl 分子不断减少，导致盐酸浓度下降，所以这一步反应较困难，往往要经过 24 小时以上才能水解完全，且产率较低。 5.2.4 2， 4-二羟基 -3-甲氧基 -4-异戊烯氧基查尔酮反应属于酚的取代反应，在 K2CO3 溶液形成的碱性条件下，酚羟基解离成酚盐负离子，与溴代异戊烯基发生亲核取代反应。但是 2位羟基没有发生取代，因为 2 位羟基与邻位羰基形成分子内氢键，比较稳定，不容易被取代。由于 4羟基也易与溴代异戊希基发生亲核取代反应，生成杂质，因此产物不 易分离，产率极低。由于溴代异戊希基得活性强，因此该步骤反应时间较短。 5.3 从结果中得知，比较两种合成路线，合成路线（一）优于合成路线（二），产物率高，操作简单，成本低，反应时间快。 5.4 本实验的药理实验采用小鼠强迫游泳实验。强迫动物游泳模型属于行为绝望(behavioral despair) 抑郁模型 ,该模型利用动物不能逃逸出恶劣环境 ,以致行为绝望而设计出的一种模型。它的理论依据与人类抑郁症中慢性、低水平的应激源导致抑郁症的发生并加速抑郁症发展的机理更接近 25。在实验中，在对小鼠腹腔注 射给药 30 分钟后，将小鼠放入XSC小鼠恒温游泳仪内 (水深 10cm、直径 35cm 的桶内，水温 252oC)，使小鼠处于一个