青花菜生物活性物质及抗氧化活性研究【毕业论文】.doc

1、毕业论文 文客久久网 本科 毕业论文 (设计 ) 题 目： 青花菜生物活性物质及抗氧化活性研究 学 院： 学生姓名： 专 业： 食品质量与安全 班 级： 指导教师： 起 止 日期： 毕业论文 文客久久网 目 录 摘要 . 2 ABSTRCT . 3 1 前言 . 3 1.1 青花菜芽 . 3 1.2 青花菜 . 3 2 实验材料、主要仪器与试剂 . 4 2.1 实验材料 . 4 2.2 主要仪器 . 4 2.3 主要试剂 . 4 3 实验方法 . 5 3.1 叶绿素和类胡萝卜素含量测定 . 5 3.2 维生素 C 含量测定 . 6 3.3 总多酚含量测定 . 6 3.4 抗氧化能力测定 . 7

2、 3.5 青花菜芽中芥子油苷含量测定 . 7 4 实验结果及讨论 . 8 4.1 叶绿素及类胡萝卜素 . 8 4.2 维生素 C . 8 4.3 总多酚 . 9 4.4 抗氧化能力 .10 4.5 芥子油苷 .10 5 结论与意义 .12 5.1 结论 .12 5.2 意义 .13 参考文献 .15 致谢 .17 毕业论文 文 客久久网 青花菜生物活性物质及抗氧化活性研究 摘要 本论文对青花菜 花球、茎和青花菜芽的主要生物活性物质及抗氧化活性进行比较和研究。结果表明，青花菜和青花菜芽含有丰富的叶绿素、类胡萝卜素、维生素 C 和多酚等多种生物活性物质，且具有较高的抗氧化能力；青花菜芽维生素 C、

3、多酚等生物活性成分和抗氧化能力显著高于青花菜花茎和花球，青花菜芽中多酚含量高达 138.25mg/100g FW，分别为花球的 1.88 倍，茎的 8.16 倍，青花菜不同器官的抗氧化能力与多酚含量成正比，青花菜芽的抗氧化活性最强，花球次之，茎最弱；青花菜芽还含有丰富的抗癌活性成分芥子油苷，其总的芥子油苷含量达 13.288mol/g FW，其中最主要的芥子油苷为萝卜硫苷，含量达 到7.619mol/g。 关键词 青花菜；青花菜芽；生物活性物质；抗氧化能力毕业论文 文 客久久网 Study on the bioactive compounds and their antioxidant cap

4、acity in broccoli (Brassica oleracea var.italica) Abstract This paper investigated and compared the main bioactive compounds and their antioxidant capacity in broccoli sprouts and the head,stem of themature broccoli.The results showed, broccoli and broccoli sprouts contained vari-ous bioactive compo

5、unds,such as chlorophylls,carotenoids,ascorbic acid,polyphen-ols, and had higher antioxidant capacity. Broccoli sprouts had higher content o-f ascorbic acid and polyphenols as well as antioxidant capacity than mature br-occolis.The content of polyphenols in broccoli reached up to 138.25mg/100g FW,wh

6、ich was 1.88 times of the head and 8.16 times of the stem,respectively.The antioxidan-t capacity of brocollis different organs was proportional to their content of pol-yphenols.The highest antioxidant capacity was observed in broccoli sprouts;thehead came second and the lowest antioxidant capacity w

7、as observed in stem.Br-occoli sprouts were rich in anti-ancer active ingredients,whose total content wa-s up to 13.288mol/g FW. The main glucosinolate was glucoraphanin,whose content wasup to 7.619mol/g. Key words Broccoli;Broccoli sprout;Bioactive compounds;Antioxidant capacity毕业论文 文 客久久网 1 前言 1.1

8、青花菜芽 青花菜芽看起来像苜蓿芽，但尝起来却像萝卜。它具有很高的营养价值，特别是含有芥子油苷、多酚等多种生物活性物质 1。芥子油苷 (glucosinolates)是一类含硫和氮的植物次生代谢产物，十字花科植物中含有丰富的芥子油苷，其降解产物异硫代氰酸盐可以作为致癌物的阻断剂，诱导醌还原酶等解毒酶的活性 2。吲哚 -3-甲基芥子油苷的降解产物吲哚 -3-甲醇可强烈诱导肝、肠酶的活性 3,4。研究发现 3-4 天的青花菜芽中芥子油苷含 量比完全成熟的青花菜中高 20 倍 5。除芥子油苷外，多酚 (total phenols)也是青花菜芽中一类重要的生物活性物质，它在抗诱变、抗衰老、抗肿瘤、抗微生

9、物及抗病毒等方面具有显著的作用，被认为是潜在的抗突变和抗癌物质。 多酚物质能抑制血小板的聚集和粘连 ,具有抑制脂新陈代谢中的酶作用 ,而且能诱导血管等的血管舒张 ,从而可以防止中风、抗血栓病、治疗糖尿病及动脉粥状硬化等。 1.2 青花菜 青花菜又名青花椰菜、意大利花菜、意大利芥蓝、木立花椰菜、绿花菜、茎椰菜、西蓝花。十字花科，芸薹属，一、二年生草本植物。甘蓝 种中以绿花球为产品的一个变种。以主茎及侧枝顶端形成的绿色花球为产品营养丰富，色、香、味具佳，是国际市场十分畅销的一种蔬菜，青花菜与白菜花都是甘蓝的变种。从外观看比白花菜粗糙，但营养价值与风味皆比白花菜高，蛋白质、氨基酸及维生素的含量均高于

10、白花莱，且栽培容易，供应期长，很有发展前途。青花菜是一种食用其小花蕾和嫩花茎的蔬菜，与白花菜、卷心菜同属甘蓝类蔬菜。青花菜是这三种蔬菜中营养最齐全，维生素、矿物质、蛋白质含量最高的。与白花菜比较，核黄素含量高一倍，维生素 C 含量高 3 倍（青花菜维生素 C 含量比番茄高 4 倍），钙含 量高2.5 倍，还含有丰富的 B 族维生素和叶酸。 青花菜中的叶绿素对人体有很好的保健功能，它是天然的造血原料，能够提供维生素 C，还可以维持酶的活性，增强机体的耐受力，是人体的健康卫士。叶绿素有助于克制内部感染与皮肤问题。 Temple 大学在 1200 名病人上，尝试用叶绿素治疗各种病症，效果极佳。而青花

11、菜中的类胡萝卜素是 一类重要的天然色素的总称，属于化合物。它可以增强机体的免疫功能，保护机体免受细菌、病毒等侵害，并有抑制癌细胞，预防癌症的效果 6。 维生素 C 在青花菜中含量也非常丰富， 维生素 C（ Ascorbic Acid）又叫 L-抗坏血酸，是一种水溶性维生素。它不仅能促进氨基酸中酪氨酸和色氨酸的代谢，延长肌体寿命，还可以改善铁、钙和叶酸的利用，改善脂肪和类脂特别是胆固醇的代谢，预防心血管病。此外，还有促进牙齿和骨骼的生长，防止牙床出血的功能。 类胡萝卜素、维生素 C、总多酚等植物天然抗氧化剂具有清除自由基的作用，研究表明，青花菜具有较强的抗氧化能力 1,7。 本文以青花菜的不同器

12、官为研究对象，从青花菜综合利用的角度，研究不同器官中生物活性物质及抗氧化能力的差异，为解决青花菜各个器官的开发利用提供理论依据。 毕业论文 文 客久久网 2 实验材料、主 要仪器与试剂 2.1 实验材料 青花菜芽培养： 1) 浸种 选择粒大的种子，除去杂物和不饱和的籽粒，先用清水洗净种子，然后用清水浸泡种子， 水量是种子的 2-3 倍，浸泡 6 个小时（夏季浸泡时间短一点，冬季长一点），浸完后把种子用清水洗净捞出。 2) 装盘 在干净的育苗盘（本实验采用的是托盘）铺上 2、 3 层餐巾纸，用喷壶把纸巾喷湿，然后铺上泡好的青花菜芽种子。种子在避免重叠的前提下尽量密播，每盘播种两以 75 80 克

13、为宜。然后姜育苗盘置于恒温箱中，并用湿报纸覆盖以保持湿度，温度控制在 18 23，湿度控制在 65 68%以上。 3) 喷水 保持湿度是成产青花菜芽的关键，因此每天要喷水，一般采用喷雾方法，每天喷 2 次。 4) 成熟 当青花菜芽叶子充分展开，苗高达到 10 厘米，刚长处真叶时，就是青花菜芽成熟的时候了。接下来就可以对青花菜芽中的一些活性物质进行检测了。 青花菜芽：菜场采购新鲜青花菜。 2.2 主要仪器 仪器 型号 厂家 紫外分光光度计 721 型 南京金牛告诉分析仪器有限公 司 电子顶载天平 TD 型 余姚金诺天平仪器有限公司 电热恒温水浴锅 HHS 型 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 生化

14、培养箱 250B 型 金坛市新航仪器厂 低速大容量离心机 DL-5 型 上海安亭科学仪器厂 移液枪 1001000 l 北京科学仪器 高效液相 色谱仪 LC-2900 型 上海天普仪器分析有限公司 2.3 主要试剂 试剂 （规格） 厂家 CaCO3 国药集团化学试剂有限公司 丙酮 国药集团化学试剂有限公司 草酸溶液 国药集团化学试剂有限公司 2， 6 二氯靛酚 上海酶联生物科技有限公司 福林 -酚试剂 1mol/L， 50mL(FB0467) 上海生工 没食子酸 上海生工 毕业论文 文 客久久网 碳酸钠 （分析纯） 设备科 无水乙醇 （分析纯） 设备科 冰醋酸 （分析纯） 设备科 乙腈（色谱纯

15、） 常青化工 三吡啶三吖嗪 (1g) Sigma 三水乙酸钠 宜兴市化学试剂三厂 乙酸 国药集团化学试剂有限公司 盐酸 宜兴市化学试剂三厂 六水三氯化铁 宜兴市化学试剂三厂 七水 硫酸亚铁 宜兴市化学试剂三厂 无水乙醇 国药集团化学试剂有限公司 浓硫酸 国药集团化学试剂有限公司 降胆葡胺 中国医药上海化学试剂公司 醋酸吡啶 中国医药上海化学试剂公司 硫酸酯酶 中国医药上海化学试剂公司 黑芥子硫苷酸钾 中国医药上海化学试剂公司 3 实验方法 3.1 叶绿素和类胡萝卜素含量测定 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根

16、据朗伯 比尔定律 8，某有色溶液的吸光度 A 与其中溶质浓度 C 和液层厚度 L 成正比，即 A CL。 （ 式中： 比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为 1cm 时， 为该物质的吸光系数。 ） 各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得 9。 1) 称取 干净 的新鲜样品 0.5g，共 3 份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及 23ml95乙醇，研成均浆，再加 80%乙醇 5ml，继续研磨至组织变白。静置 3 5min。 2) 取滤纸 1 张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到 25ml 棕色容量瓶中，用

17、少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。 3) 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。 直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至 25ml，摇匀。 4) 把叶绿体色素提取液倒入光径 1cm 的比色杯内。以 80乙醇为空白，在波长 663nm、645nm、 652nm、 470nm 下测定吸光度 10。 毕业论文 文 客久久网 3.2 维生素 C 含量测定 2， 6 二氯靛酚是一种染料，在酸性溶液中呈红色，被维生素 C 还原后红色消失 11。一定量的样品提取液还原标准染料的量与样品中维生素 C 量成正比。 1) 样品处理：样品洗净剪碎，称取 100g，放

18、入研钵，并加入同体积的 2%草酸溶液和碳酸 钙制成匀浆； 2) 称取匀浆液 10g，用 1%草酸溶液定容至 50ml； 3) 将匀浆液过滤，取滤液 5ml，以标定过的 2， 6 二氯靛酚滴定至溶液呈粉红色，且 15s内不褪色，记录用量。另 取 5mL 1%草酸溶液做空白对照，记录所用 2， 6 二氯靛酚体积。 3.3 总多酚含量测定 多酚类化合物分子上有极易氧化的羟基，在碱性条件下与福林 -酚试剂反应后呈现蓝色，此反应物在 765nm 处有最大吸收，一定条件下遵从朗伯 -比耳定律，以没食子酸为基准物质可测定苹果多酚的总量 12。 1) 溶液配制： 7.5%Na2CO3 溶液：称取 7.5g N

19、a2CO3 粉末，溶于 100mLddH2O 中，微热混匀，冷却后使用。 30%乙醇溶液：量取无水乙醇 150mL， ddH2O350mL，混匀后使用。 0.2mol/L 福林 -酚试剂：量取 1mol/L 福林 -酚试剂 5mL， ddH2O20mL，混匀后使用。 2) 标准曲线的制定： 对照品标准溶液配制：精确称取没食子酸标准品 100mg，用乙醇溶解并定容到 100mL， 得 到 1mg/mL 的对照品标准溶液。 标准曲线的制备：精密吸取上述对照品溶液 0.05、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6mL 于10mL 离心管 中，定容至 5mL。准确移 取 0.3mL

20、 稀释后的溶液，加入 1.5 mL0.2mol/L 的Folin-Ciocalteus 显色剂，混匀， 3min 后， 加入 1.2mL 饱和碳酸钠 (7.5%)，混合均匀，在室温、避光条件下 （生化培养箱） 放置 1-2h，用分光光度计测定 760nm 处的吸光度值。 由吸光度对浓度进行回归，求得标准曲线。 3) 样品测定： 准确称取 0.2g（表 1）冻干粉于 50mL 离心管中，加入 25mL30%乙醇， 100（或 80）水浴 1h，然后 7000rpm 离心 10min，吸取上清液作为多酚提取液。 取提取 液 50l 分别加入1.5 ml 0.2mol/L 的 福林 -酚 溶剂、 混

21、匀， 3min 后，再加入 1.2ml 饱和碳酸钠 (7.5%)。静置 1-2h，在 760nm 下测波长用乙醇作对照。多酚含量在没食子标准曲线的基础上计算出来的， 含量以等同于没食子酸（ gallic acid equivalent）的量表示， 即每克干物质中没食子酸的含量，表示为 mg/g DW，或折算成每 100g 鲜重中没食子酸的量，表示为 mg/100g FW。 表 1 0.2g 冻干粉相对应的样品含量一览表 样品 青花菜芽 花球 茎 水分含量 93% 86.87% 88.97% 0.2g 冻干粉所需湿重（ g） 2.86 1.52 1.77 毕业论文 文 客久久网 3.4 抗氧化能

22、力测定 酸性条件下抗氧化物可以还原 Fe3+-TPTZ 产生蓝色的 Fe2+-TPTZ，随后在 593nm 测定蓝色的 Fe2+-TPTZ 即可获得样品中的总抗氧化能力 13。 1) 溶液配制： 300mM 醋酸缓冲溶液 (Ph=3.6)：称取 0.775g 三水乙酸钠粉末，溶于 4mL 乙酸中，混匀后备用。 40mM 盐酸：量取 36%浓盐酸 0.1ml 加水至 30ml，混匀后备用。 10mMTPTZ 溶液：称取 TPTZ 样品 78.08mg，用 40mM 的盐酸定容至 25mL，冷藏备用。 20mM 三氯化铁溶液：称取 135.3mg 六水三氯化铁，用蒸馏水定容至 25ml，混匀后备用

23、。 FRAP 工作液： 250ml 醋酸缓冲溶液中加入 25mlTPTZ 溶液， 25ml 的三氯化铁溶液，混匀后备用。 (10： 1： 1) 2) 标准曲线的制定： 对照品标准溶液配制：精确称取 七水硫酸亚铁 139mg， 溶于适量水中，加入 18M 硫酸0.25ml，再加水定容至 100ml。 标准曲线的制备：精密吸取上述对照品溶液 0.025、 0.05、 0.1、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0mL于 10mL 离心管 中， 用蒸馏水 定容至 5mL。准确移取 0.3mL 稀释后的溶液，加入 2.7 mL 预热的 FRAP 工作液 ，混匀， 37水浴 10min 后 ，

24、用分光光度计测定 593nm 处的吸光度值。由吸光度对浓度进行回归，求得标准曲线 。 3) 样品测定 称取 0.2g 冻干粉（是植物材料不同用量不同）于研钵中，加入 5ml30%乙醇，充分研磨后转移到 50mL 离心管中，用 30%乙醇定容至 25ml， 100（或 80）水浴 1h，然后 7500rpm离心 10min，吸取上清液作为提取液。 取提取 液 0.3ml 分别加入 2.7ml 预热 的 FRAP 工作液，混匀， 37水浴 10min 后， 在 593nm 下测波长 ，在 FRAP 工作液中加入无水乙醇 用作对照。样品抗氧化活性（ FRAP value）以达到同样吸光度所需的硫酸亚

25、铁的毫摩尔数表示。 3.5 青花菜芽中芥子油苷含量测定 根据我们以前的报道进行 (Jia et al., 2009b; Yuan et al., 2009)芥子油苷的提取和测定。称取样本 500 mg，加入 4ml 煮沸的 ddH2O 按比例提取，加水后在沸水中煮 10 min，吸取提取液，剩下的材料加入 4ml 煮沸的 ddH2O，煮沸 10min 后继 续提取合并提取液。称取 50mg 降胆葡胺（ DEAE-Sephadex）用 0.5 M 醋酸吡啶浸泡过夜，转移到 Bond-Elute 中；用 2 ml 0.5 M 醋酸吡啶活化， 1 ml ddH2O 淋洗；加入 1ml 提取液后分别用

26、 3ml of 0.02 M 醋酸哌啶 和 2 ml 蒸馏水淋洗，加入 75l 0.1% 硫酸酯酶过夜，脱硫芥子油苷用 1 ml ddH2O 洗脱。 20l 样品溶液用于色谱分析，色谱条件为：柱温， 30；流动相：乙腈和水按照 1.5%（乙腈）， 5min； 1.5-20%， 15 min； 20%， 10 min 梯度；流速 1.0 ml min1，检测波长 226和 280 nm（ Grubb et al., 2002; 2005）。用黑芥子硫苷酸钾作为内标，各芥子油苷响应系数和浓度计算根据前人的报道进行 (Brown et al., 2003) 。 毕业论文 文 客久久网 4 实验结果及

27、讨论 4.1 叶绿素及类胡萝卜素 图 1 叶绿素与类胡萝卜素含量计算结果与验证（单位 /mg） 青花菜芽和花球均为绿色，其叶绿素含量较高，而茎中叶绿素含量最低。由图 1 中的数据可知，青花菜芽中的叶绿素含量最高，显著高于花球和茎中的含量。青花菜芽中的总 叶绿素含量达到 11.416mg/L，为花球中的 2.956 倍，为茎中的 15.768 倍。而茎中的类胡萝卜素含量最高，其次是芽，花球中含量最低。结果表明，青花菜芽中的叶绿素和类胡萝卜素含量丰富，具有较强的应用潜力。 4.2 维生素 C 图 2 各样品维生素 C 含量 图 2 表明青花菜芽中的维生素 C 含量最高，达到 91.42mg/100g FW，显著高于花球和茎中的含量，花球中含量最低，为 59.35mg/100g FW，为芽的 65%。数据表明，青花菜芽中含 有丰富的维生素 C，远远超过成熟青花菜植株中的含量，极具开发潜力。