基于AFLP标记的梭鱼群体遗传多样性分析【毕业论文】.doc

1、 本科毕业论文 （ 20 届） 基于 AFLP 标记的梭鱼群体遗传多样性分析 所在学院 专业班级 农业资源与环境 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 中文摘要 . 1 英文摘要 . 2 1. 前言 . 4 1.1 梭鱼研究现状 . 4 1.2 AFLP 标记的基本原理及特点 . 5 2. 材料和方法 . 7 2.1 样本来源 . 5 2.2 实验操作 . 5 2.3 数据处理 . 8 3. 结果 . 9 3.1 AFLP 扩增结果 . 9 3.2 梭鱼各个群体遗传分化及聚类树分析 . 10 4. 讨论 . 13 致谢辞 . 错误 !未定义书签。 参考文献 . 13 摘要 梭

2、鱼是我国沿海的重要经济鱼类，在西北太平洋区有广泛的分布。 本研究利用 AFLP技术对西北太平洋海域的 8 个群体 91 个个体梭鱼的遗传多样性进行了分析 ， 4 对选 择性引物在 91 个个体中共扩增产生 186 个扩增位点，其中多态位点 97 个，多态位点比列为 52.15%。不同引物扩增出的位点数差异较大，从 39-62 不等 。 在 8 个梭鱼群体中，青岛群体多态位点比例和 Nei 遗传多样性指数最高，云林群体多态位点比例和 Nei 遗传多样性指数最低。 梭鱼两两群体的 FST值在 0.0667 和 0.5505 之间，并且所有的 FST值都差异极显著（ P0.01） 。 8 个群体的聚

3、类树 和所有个体的 UPGMA 聚类树 显示梭鱼群体分为两支，珠江和云林群体一支（南方种群），其余中国群体和日本两个群体聚为一支（北方种群） ， 并且两个种群间无个体的交叉， AMOVA 分析结果表明，南北种群间遗传 差异显著。本研究表明梭鱼南北两个种群是两个隐蔽种。 关键词 梭鱼 扩增片断长度多态性 (AFLP) 遗传 结构 种群 Abstract Liza haematocheila is an important commercial fish in Northwestern Pacific， and it is widely distributed in the coastal. In

4、 this study, AFLP technology is used to analyze the genetic diversity of Liza haematocheila in the coastal of China and neighboring seas. Four primer combinations amplified 423 loci among 91 individuals, including 265 polymorphic loci. The proportion of polymorphic loci, the Nei genetic diversity of

5、 8 populations varied from 22.73% to38.46%, 0.0890 to 0.1422 , respectively. UPGMA trees and AMOVA analysis showed that complete break between north and south groups., supporting different cryptic species in north and south populations. Key words Liza haematocheila Amplified Fragment Length Polymorp

6、hism (AFLP ) Genetic structure Population 1 前言 1.1 梭鱼研究概况 1.1.1 梭鱼分布与习性 梭鱼 (Liza haematocheila)属于硬骨鱼纲， 鲻形目 ， 鲻 科，梭鱼属，俗称齿眼梭鲻等 1。梭鱼体呈纺锤形，头短而宽，眼稍呈红色，脂眼睑不发达，仅仅存于眼边缘。外表覆盖有大鳞，体侧纵列鳞有 41-47，背侧呈现青灰色，背鳍两个，第一背鳍起点距吻端较距尾鳍近。胸鳍基部无腋鳞，尾鳍凹形。腹部则呈现浅灰色，两侧鳞片有黑色竖纹。主要栖息在江河口和海湾内，我国有广泛分布，尤以渤海、黄海居多。喜群集生活，以水底泥土中的有机物为食。他们的生活习性具

7、有广盐性和广温性，但温度的变化需要渐变，而若骤然改变温度，就容易造成死亡。梭鱼适宜生活在 PH 值为 7.69.3 左右， 它们对氧有较大的生态耐性，耗氧量随个体的增大而增加 。 梭鱼属于硬骨鱼纲的鲻形目，众所周知鲻科鱼类 (Mugilidae)是知名的世界性分布的经济鱼类，是沿海常见的经济鱼类。性活跃，为广温、广盐性鱼类，可以栖息于淡水中，而梭鱼（ Liza haematocheila）是亚洲地区鲻科鱼类中最主要的经济代表种。梭鱼幼鱼以浮游动物为主食，成鱼主食底栖硅藻类，也食底层有机质。梭鱼肉味鲜美，营养很丰富，梭鱼具广盐、广温、食物链短、生长快速、病害少、繁殖力强等特点，是一种具有前途的增

8、殖种类 2-4。 1.1.2 梭鱼概况 梭鱼是黄渤海常见的经济 食用鱼类 ，主要栖息在 海口 河川咸淡水交汇处，春季三四月份于河口附近产卵，幼鱼时常随潮溯河在河口处生存，成为海港主要养鱼对象之一。目前有关梭鱼的研究主要集中在渔业生物学、组织胚胎发育、人工育苗和养殖技术等方面 2 ,5 。 渔民利用幼鱼的溯河性，在 5 月上旬将幼鱼随潮纳入港内放养，幼鱼 生长很快，秋天的时候就可长到 200 毫米， 10 月末即可收获。根据梭鱼的生活习性，捕捞方法可以为定置网、钩钓等。食用梭鱼的最佳时期在春季， 民间就有 “食用开凌梭，鲜得没法说 ”的说法。梭鱼属一次产卵型鱼类，渤海雌梭鱼 4 龄性成熟，黄海

9、3-4 龄，东海 3 龄，产卵期渤海在 5-6 月，浙江沿海在 4 月上旬到 5 月上旬，广东沿海在 9-11 月。 目前有关梭鱼群体遗传学研究主要集中在形态学、线粒体 DNA、 RAPD 和同工酶标记等方面。在形态学研究方面，李明德根据梭鱼筛骨的形态，将其分为 3 个形态型：弧形、平直型及 V 型， 3 者同时分布于自然海 区 3。宋佳坤等比较了 59 尾采自广东合浦、北海，广东湛江、广州、汕头，福建集美、温州、舟山、天津等地的梭鱼样品进行了形态比较研究，认为我国沿海梭鱼同日本沿海梭鱼为同一种类 6。孟玮利用棱梭作为外群研究了我国沿海不同地点梭鱼的形态特征地理变异，单因子方差分析表明，梭鱼各

10、群体间不存在明显的形态变异 7。Meng 等利用同工酶标记对丹东、日照、宁波和广州梭鱼 4 个群体的遗传结构进行了研究，在10 种酶中，共检测到 14 个位点，各群体多态位点比例为 0.07-0.14，群体间遗传距离在0.0004-0.0021 之间， 结果显示广州群体与其余三个群体遗传距离差异相对较大 8。杨锐等利用同工酶标记对野生群体和养殖群体梭鱼遗传变异进行了研究，在 10 种酶中共检测到 22 个位点。自然群体和多态位点比较较高。在养殖群体中两个位点观察到相当多的杂合子 , 导致这两个位点杂合度远大于自然群体 , 进而造成养殖群体平均杂合度高于自然群体的平均杂合度。养殖群体在其中两个位

11、点杂合度较高的原因 , 可能与养殖过程中环境因素造成的蛋白质表达的个体差异有关。两个群体的 Nei 遗传距离很近 ,为 01009; 遗传相似程度很高 , 遗传相似性系数达 019919。 权洁霞等利用 RAPD 标记对黄河口海域的梭鱼野生和养殖群体的遗传多样性进行了研究，结果表明黄河口附近海域的梭鱼遗传多样性较高，人工养殖过程未对其造成影响 10。 幼体的扩散在海洋生物生态和进化过程中扮演了极为重要的角色 11,12。许多海洋生物的浮游幼体可以借助洋流扩散 ， 这有可能导致距离很远的群体间产生基因交流。这些具有较强的潜在扩散能力的海洋生物通常在很大的地理范围内表现出很低的遗传分化。梭鱼其幼体

12、的浮游生活期约为四周。 期间，一些 体长为 11 20 mm 的幼体开始集群并向近岸及河口区迁移13-14。 若梭鱼群体随着洋流进行迁移，则群体内的基因交流会比较频繁，其扩散能力也较强 。为检验梭鱼的幼体扩散对梭鱼遗传结构的影响， Liu 等采用线粒体 DNA 对梭鱼分布范围内 9个群体 272 个个体进行了研究 15。共检测到 3 个不同的单倍型类群 ,这 3 个单倍型类群可能是在更新世冰期被隔离在 3 个边缘海内而产生的分化。这一研究结果与以往的假设相反 ,3 个单倍型类群在地理上的频率分布存在很大差异。分子方差分析和群体多样性指数都表明 3 个边缘海内的梭鱼群体间存在显著的遗传差异。这些

13、结果表明 :与基于生物学特性预期 的梭鱼具有较高的扩散能力相反 ,梭鱼群体空间上的基因交流是很有限的。东海的梭鱼群体间缺乏系统地理格局 ,这可能是因为末次冰盛期后梭鱼群体发生了近期的栖息地扩张 ,群体间没有足够的进化时间在迁移 -漂变间取得平衡。由于线粒体的母系遗传，梭鱼 3 个线粒体类型是否是已经分化完成的 3 个隐蔽种还是仅是 3 种线粒体的类型尚未解决。 图 1-1 梭鱼 Fig1-1 Picture of Liza haematocheila 1.2 AFLP 标记的基本原理及特点 1.2.1 AFLP 标记的基本原理 AFLP (Amplified fragment length p

14、olymorphism)是 将 RFLP 标记 与 RAPD 标记 相结合的一种分子标记技术， 这使得其获得“最有力的分子标记”称号。这也使得其兼备了 RFLP 标记的专一性可靠性 ,以及 RAPD 标记的随机性方便性 16。 因其 通过选用不同的内切酶来达到选择性扩增的目的 ,故 又被称作选择性限制片段扩增标记 （ SRFA)。 AFLP 技术的原理 ： 对基因组酶切 片段进行选择性的扩增 ，将基因组的 DNA 用限制性内切酶进行切割， 形成不同 的 酶切位点 以及 分子量大小不等的随机性酶切片段 ，接着 在其两端接上双链的人工接头，形成 DNA 模板。 这些 特异性片段经过变性、退火、延伸

15、周期性的循环之后 被扩增， 这些 长度不同的扩增片段即 为 多态性片段 。 Vos 等采用 Mse 和 EcoR 组合对phase、 AcNPV 等大小在 48.816000 kb 之间的四个物种的基因组进行了 AFLP 的反应原理进行验证 17，结果 显示 检测到的酶切片段数与预测的酶切片段数完全一致，这充分证明了 AFLP技术原理的可靠性。 AFLP 分析的 接头 和 引物都是由人工合成的双链核苷酸序列。接头一般由一个核心序列和一个酶专化的序列组成 ，通常 有 1418 个碱基对 。 引物由三部分组成 :与人工接头互补的 5端的核心碱基序列 (Core sequence， CORE)、 应

16、于限制性酶切片段的限制性末端 的 特异性酶切序列 (Enzyme specific sequence, ENZ)和 3端选择性碱基 (Selective extension, ENT)。 引物只识别和扩增 在两个酶切末端内侧且与选择性碱基互补的限制性片段。 此方法中， 引物的核心序列与接头部分 是 相互 对应 的 ， 所以两者必须遵照相同的实验原则 :(1)为避免接头之间的互相连接，对接头不进行磷酸化。（ 2)C 和 G 的含量适宜，一般而言，两者相加总量要大于一半。 (3)接头与限制性片段连接后要确认原来的限制性内切酶位点不能恢复。 实验所产生的 扩增产物的多少主要取决于 两个因素：（ 1）

17、 引物 3末端的选择性碱基的数目 （ 2） 引物 3末端的核苷酸组成。 一般而言， 选择性碱基数不超过 3 个， 基因组 DNA 大于108bp 的选用 3 个选择性碱基，基因组 DNA 在 105106bp 的选用 2 个选择性碱基，在 此 范围内每增加一个碱基 会 减少 1/4 的扩增带 谱。 通过研究， Vos 等人发现 碱基数目越多，错配的概率越大，甚至可能出现假带的情况。一般而言， C、 G 含量若越高，扩增产物会越少，而对于有大量 A、 T 的基因组来说，用含有它们的选择性碱基可获得数量更多的扩增片段。此说法也被 Hansen 和 Qi 在研究 中证明。 1.2.2 AFLP 标记

18、的特点 （ 1） DNA 需求量少且可被用于 线粒体 DNA。 RELP 研究中从线粒体里获得大量的 DNA 是很困难的。 AFLP 对模板浓度变化要求不高 ， 浓度范围在 1000 以内影响不大，故其产生的指纹图谱十分相似。 （ 2）较强的多态分辨能力。改变限制性内 切酶 或者 选择性碱基的种类 及 数目 可以调节扩增的条 带数。 人工接头可以被不同设计，因此搭配产生不同的引物，这便使得搭配有较高的灵活度，这也使其能检测出大量的多态片段，从而超越了其他分子标记法。较好的重复性 。 AFLP是在有无电泳条带的基础上分析的 ,DNA 的质量越高或者酶的过量都可以免除由 DNA 酶切的不完全而产生

19、的失真 ,在 PCR 里，退火温度较高或者所用的引物较长都可以将在扩增中出现的错误减少到最低限度 ,从而可以说 AFLP 分析可重复性较强。 （ 3） 较好的重复性 。 AFLP 是在有无电泳条带的基础上分析的 ,DNA 的质量越高或 者酶的过量都可以免除由 DNA 酶切的不完全而产生的失真 ,在 PCR 里，退火温度较高或者所用的引物较长都可以将在扩增中出现的错误减少到最低限度 ,从而可以说 AFLP 分析可重复性较强。 （ 4） 随机性强，没有放射性危害。研究中 不需要预先 得知 被分析的基因组 DNA 的序列信息。 （ 5）高分辨率。 AFLP 的 扩增片段 较 RFLP 分析法而言较

20、短，适合 在 变性序列凝胶上 进行 电泳分离， 因此 片段多态性检出率高，内部多态性 就不 会被掩盖。 （ 6）样品适用性广。任何来源的样品都适用于 AFLP 标记技术包括各种复杂度不一的 DNA ,例如细胞质 DNA、质粒、个别基因或某段基因片段 , 同时在标记时并不需要事先知道这些 DNA的序列。用同样的一组限制酶、引物 ,可以对各种生物的 DNA 分子进行遗传标记研究。 （ 7）遗传性稳定。 AFLP 标记在后代中的遗传和分离运用中符合 Mendel 的遗传规律，而种群中， AFLP 标记又遵循了 Hardy Weinberg 平衡说，因此，从技术特点角度而言， AFLP 实际上是 RA

21、PD 和 RFLP 相结合的标记方法。 AFLP 既克服了 RFLP 技术的复杂性、放射性危害以及稳定性差、在标记中出现隐性遗传的缺点，同时又兼具有两者的优点。近几年来 ，人们不断将这一技术完善和发展，使得 AFLP 迅速成为迄今为止最有效的分子标记 19。 1.2.3 AFLP 标记的应用 AFLP 是一种较新的分子标记的技术 ,公开应用时间不长 ， 因此还没被应用到生物学研究的各个领域。但是该标记的优点已被广大研究者认识到 ， 因此具有良好地应用前景 。 目前 ,AFLP标记已经在遗传多样性检测、居群遗传结构还有遗传分化分析、物种亲缘关系的分析、种质资源的鉴定、基因流测定等方面得到了较为广

22、泛的应用 20。 AFLP 技术在水产动物遗传多样性分析中已广泛应用 ， 在贝类、对虾 、大黄鱼、小黄鱼、真鲷、 牙鲆等经济水生生物上开展了大量的研究 21-32 。 1.3 本研究的目的与意义 梭鱼是亚洲地区鲻科鱼类中最主要的经济代表种。 目前由于过度捕捞、环境污染等人类活动的影响，梭鱼类的资源量急剧下降，开展梭鱼的遗传多样性保护显得十分重要。有关梭鱼的线粒体 DNA 序列研究显示在梭鱼群体内存在 3 个显著分化的单倍型类群，并且 3 个类群频率在不同海区存在显著差异。有关 3 个单倍型类群是否代表显著分化的隐蔽种还是只代表群体内不同的母系起源，目前尚无定论。在梭鱼近缘种鲻鱼群体内也发现了

23、3 个显著分化的线粒体类群，结合微卫星标记，研 究发现 3 个单倍型类群代表了不同的隐蔽种 33。因此梭鱼 3个单倍型类群的分类地位值得探讨。本研究采用 AFLP 标记，从核基因角度研究不同梭鱼群体的遗传变异，探讨梭鱼 3 个单倍型类群的间的关系。 2 材料和方法 2.1 样本来源 实验所用梭鱼取自 8 个不同地理群体涵盖 Liu 等所检测到的梭鱼 3 个单倍型类群，分别是我国沿海的丹东、日照、青岛、宁波、珠江、云林和日本的大分、函馆，共采集了 91 个样品（表 2-1）。样品冷冻运回实验室后，取背部肌肉经过酒精固定后保存。 表 2-1 梭鱼各个种群采样情况以及扩增状况 Table 2-1 P

24、arameters of genetic diversity for populations of Liza haematocheila 群体 样本 数 采集日期 总扩增点数 多态位点数 多态位点比例 Nei 基因多样性指数 日照 (RZ) 12 Jul.2004 159 57 0.3585 0.1347 丹东 (DD) 12 Apr. 2004 157 56 0.3567 0.1355 青岛 (QD) 12 May. 2005 156 58 0.3718 0.1401 珠江 (ZJ) 12 Apr. 2005 145 48 0.3310 0.1203 宁波 (NB) 11 Jun. 2004

25、 142 43 0.3028 0.1156 云林 (YL) 12 Jun. 2005 132 30 0.2273 0.0890 日本大分(DF) 14 Mar. 2005 156 60 0.3846 0.1422 日本函馆(FG) 6 Mar. 2005 149 49 0.3289 0.1091 Total 91 186 97 0.5215 2.2 实验操作 采用蛋白酶 K/酚氯仿方法提取基 因组 DNA，对于基因组 DNA进行质量检测，取高质量DNA模板 50ng进行 AFLP反应， AFLP实验方法参照 Vos等，选用 EcoR 和 M se 两种限制性内切酶在 37 下进行酶切，此过程进

26、行约 56小时 , 于 70 中放置 15min，使酶失活， 4 下保存备用 。接着用 T4连接酶进行连接片段， 于 37 下反应 4h。 4 下保存备用。取 1l连接产物 进行预扩增，预扩增体系为 20ul, 预扩增反应条件为首先 94 2min；接着 94 30s， 56 60s，72 60s，共 20个循环； 4 下保持。根据 1.5琼脂糖 凝胶电泳检测预扩增效果。该产物用超纯水稀释 10倍， 然后对其进行选择性扩增； 取 5l预扩增稀释混合液， 10PCR buffer plus Mg2+ 2l， EcoRI引物 (27.8ng/l) 0.4l， MseI引物 (27.8ng/l) 0

27、.4l， Taq DNA聚合酶 0.2l,加超纯水至总体积为 20l。选择性反应条件为先 94 2min，再 94 30s， 65 30s，（每循环退火温度降低 1 ）， 72 60s， 10个循环后变为： 94 30s， 56 30s， 72 60s， 26个循 环。扩增反应 产 物 在变 性 6 丙 稀 酰胺 上 进行 电 泳， 采 用银 染 进行 检 测。 选 用 4 个 引 物组 合（ E-AGG/M-CAA， E-AGC/M-CTC， E-AGT/M-CT和 E-AGAM-CTG）进行 AFLP选择性扩增（表2-2）。 表 2-2 用于 AFLP分析法中的引物序列和接头 Table2

28、-2 Adaptor and primer sequences used in AFLP analysis Primer Sequence Adapters EcoRI-adapter 5-CTCGTAGACTGCGTACC-3 5-AATTGGTACGCAGTCTAC-3 MseI-adapter 5-GACGTGAGTCCTGAG-3 5-TACTCAGGACTCAT-3 Pre-amplification primer EcoRI 5-GACTGCGTACCAATTC-3 MseI 5-GATGAGTCCTGAGTAA-3 Selective amplification primer E

29、-AGG/M-CAA 5-GACTGCGTACCAATTCAGG-3 5-GATGAGTCCTGAGTAACAA-3 E-AGC/M-CTC 5-GACTGCGTACCAATTCAGC-3 5-GATGAGTCCTGAGTAACTC-3 E-AGT/M-CTA 5-GACTGCGTACCAATTCAGT-3 5-GATGAGTCCTGAGTAACTA-3 E-AGAM-CTG 5-GACTGCGTACCAATTCAGA-3 5-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3 2.3 数据处理 首先将电泳图谱中扩增条带的有无转化为 0， 1原始数据矩阵。采 用两种方法对 AFLP数据进行分析；其一，

30、 AFLP标记是显性标记，依据原始数据矩阵统计总位点数、多态位点数，计算 Shannon多样性指数和进行 AMOVA分析等；其二将每一个条带视为 1个位点，进行Hardy-Weinberg平衡假设，计算群体的 Nei遗传多样性指数和基因分化系数。统计的遗传学参数主要有： 多态位点比例： P=多态位点数 /位点总数 100% 遗传相似系数： Sij=2Nij/(Ni+Nj) 其中， Nij为个体 i与 j共有的条带数量； Ni、 Nj分别为个体 i与 j各自具有的条带数量。 遗传距离： D= - ln S,式中 S 为相 似系数。 Nei 遗传多样性指数 h： h0 = 1 - P2i, Pi

31、为单个位点上的等位基因频率。 基因分化系数 Gst 是衡量群体间遗传分化的指标，为总群体平均杂合度 (hs)和各群体内平均杂合度 (ht)的函数，即 Gst=1-hs/ht。 利用 Arlequin 进行 AMOVA 分析，利用 POPGEN1.32 计算 Nei 遗传多样性指数和 Shannon 信息指数 ，用 MEGA3.0 软件构建 UPGMA 系统树。 图 2-3 梭鱼的取样地点 Figure2-3 Sample location of Liza haematocheila 3 结果 3.1 AFLP 扩增结果 4对选择性引物在 8个群体 91个个体中共扩增出 186个扩增位点，其中多

32、态位点 97个，多态位点比列为 52.15%。不同引物扩增出的位点数差异较大，从 39-62不等，引物 E-AGA/M-CTG 扩增的位点数最多，引物 E-AGG/M-CAA扩增的位点数最少。每个引物扩增的多态位点比例为38.46%-57.50%（表 3-1）。 8个群体分别扩增出 159、 157、 156、 145、 156、 149、 142、 132条扩增片段。平均多态位点比率分 别为 35.85%、 35.67%、 37.18%、 33.10%、 38.46%、 32.89%、30.28%、 22.73%， (见表 2-1、表 3-1).日照群体扩增条带数最多，云林群体扩增条带数最少。 表 3-1 不同引物的扩增结果 Table 3-1 Number of bands generated by primer combinations