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生物科学毕业论文:东海陆架沉积物细菌多样研究.doc

1、 本科毕业论文 ( 20 届) 东海陆架沉积物细菌多样研究 所在学院 专业班级 生物科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 目录 摘要 .I Abstract .III 引言 . 1 1 材料与方法 . 3 1.1 材料 . 3 1.1.1 样品 . 3 1.2 实验方法 . 5 1.2.1 样品处理 . 5 1.2.2 沉积物 DNA 的提取 . 6 1.2.3 沉积物基因组总 DNA 的电泳检测 . 7 1.2.4 PCR 反应体系 . 7 1.2.5 PCR 反应条件 . 8 1.2.6 PCR 产物的纯化 . 8 1.2.7 沉积物中细菌 16S rDNA 基因克隆

2、文库的构建及测序 . 8 1.2.8 系统发育分析 . 10 1.2.9 温度梯度凝胶电泳 (TGGE)分析 . 12 2 结果与分析 . 13 2.1 DNA 的提取、纯化和 PCR 扩增 . 13 2.2 克隆文库的构建及测序 . 14 2.3 沉积物中细菌多样性及系统发育分析 . 14 3 讨论 . 25 小结 . 27 参考文献 . 28 附译文 . 错误 !未定义书签。 致谢 . 错误 !未定义书签。 I 摘要 摘要 东海是世界上著名渔场,其生态系统的动态平衡是渔场可持续健康发展的基础。细菌作为海洋微生物中分布最广、数量最大的一类生物,其对海洋生态系统动态平衡的维持具有重要的理论和现

3、实意义。 本次研究 通过构建 16S rDNA克隆文库,对东海陆架沉积物中的细菌类群组成进行了系统进化分析。 最后 共得到了 85 株有效克隆,其中 39 个克隆与数据库 中的序列相似度较高( 96%-99%)。结果表明该海区沉积物中的细菌类群主要包括 变性细菌门( 、 、 -proteobacteria),酸杆菌门( Acidobacteria),拟杆菌门( Bacteroidetes),疣微菌门( Verrucomicrobia), 放线菌门( Actinobacteria) ,厚壁菌门( Firmicutes) 6 个细菌门。另外,有 30.5%(26/85)的细菌是属于根据目前数据库中

4、的序列还无法进行分类的类群。其中 -proteobacteria 为最占优势菌群, -proteobacteria 为次优势菌群。拟杆菌类群中的细菌包括了 3 株黄杆菌( Flavobacteria)及 4 株拟杆菌 (Bacteroidetes)。 通过对细菌类群的分析表明了文库中的细菌 多样性是比较高的,而且存在了大量未获培养的细菌,代表着新的微生物属种,有待更深入的研究。 关键词 东海 ; 陆架沉积物 ; 细菌多样性 ; 16S rDNA 克隆文库 II III Abstract Abstract The East China Sea is the world famous fishin

5、g grounds, the dynamic balance of its ecosystem is the basis for the healthy development of sustainable fisheries.Bacteria,as organism have the most widely distributed and the largest number in the marine microorganism,have an important theoretical and practical significance on the dynamic balance o

6、f marine ecosystems.In this study,we analyzed the bacterial community of the East China Sea continental shelf sediment by constructing 16S rDNA clone library and phylogenetia tree analysis and so on.Finally,we obtained 85 clones,and 39 clones have high sequence similarity with the darabase(96%-99%).

7、The result showed that this sediment inculde Proteobacteria(, proteobacteria ),Acidobacteria,Bacteroidetes,Verrucomicrobia,Actinobacteria,Firmicutes.In addition,30.5%(26/85) of bacteria are based on current sequences in the database can not be classified.Where -proteobacteria was the most dominant b

8、acteria,-proteobacteria as the sub-dominant flora.Bacteroides group of bacteria including 3 strain Flavobacteria and 4 strain Bacteroides.Through the analysis to the bacterium,it showed that bacterial diversity of the library is very high,and most of them are uncultured ,this represent that there ar

9、e new species and need more research. Key words East Ch ina Se a, Sh e lf se d im ents,th e d iv ers ity of b ac ter ium, 16S rDNA clone library 1 引言 19 世纪中期,有人就分离出第一个海洋细菌, 1865 年又分理处海洋奇异贝氏硫细菌( Singular sulfur bacteria Bayesian)。海洋细菌的研究也于 1884 年开始。但在相当长的时间内,一直停留在描述、分类的水平上。 1946 年,美国 C.E.佐贝尔以海洋细菌为主要内

10、容的海洋微生物学一书的问世,促使海洋微生物的研究进入以生理、生态为基础的阶段。 1959 年以后,苏联学者 A.E.克里斯连续出版了研究深海微生物的著作,提出微生物海洋学的研究设想。 1961 年国际海洋微生物学讨论会的召开,标志着以海洋细菌为主要内容的海洋微生物已成为独立的学科。 从 20 世纪 40 年代以来 , 人们一直采用分离培养的方法来研究海洋微生物的多样性 ,即将海洋微生物从环境中分离纯化 ,然后通过一般的生物化学性状或者特定的表现型来分析 1。 但是,由于海洋环境的特异性导致海洋微生物在物种和生态功能生的多样性,且缺少适当的培养方法,对其多样性了解较少,因此关于海洋微生物的种类还

11、很有限,迄今为止能够在实验室培养的微生物不到 1%2。自1985 年 Pace 等利用核酸序列的测序来研究微生物的进化问题以来,对微生物的多样性的研究进入了一个崭新的阶段 3。通过分子生物学技术的迅速发展和计算机的广泛应用,海洋微生物生态学已经从 20 世纪 50、 60 年代海洋生物学和生物海洋学的小脚注变成了我们对海洋的兴趣焦点 4。 当今虽科技高速发展,甚至冲出地球奔向太空,但全球人口及其增长的压力、陆地资源的短缺都迫使人们比以往更多地将眼光注视海洋 5。海洋约占地球表面积的 71%,其区域环境复杂多变,高盐、高压、低温、低营养和无光照等特殊区域生态环境使海 洋微生物在物种、基因组成和生

12、态功能具有多样性 1,也使得海洋微生物拥有了比陆地微生物更丰富的多样性,为提取更多具有功能性的活性物质提供了重要来源。 海洋细菌在海洋中分布广、数量多,是海洋微生物中最重要的成员。在海洋生态系统的动态平衡维持过程中,海洋细菌以其敏感的适应能力和极快的繁殖能力扮演者不可缺少的角色。尤其近年来人类无休止、无约束的开发,使得全球近海海洋生态系统的基础生产力显著下降,严重制约了我国沿海地区的国民经济持续发展 6。所以说,海洋微生物生态学的研究有着重要的理论和现实意义。 本为采用了现今 微生物多样性研究的常用方法,采用非特异性引物扩增泥样中的细菌 DNA,构建东海细菌 16S rDNA 基因文库,然后对

13、克隆序列进行系统发2 育分析,研究沉积物中细菌群落的多样性,为生态系统功能的理解和微生物资源的开发利用提供重要的理论指导。 3 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品 采用多管采样器采集 13 号站点 (31 30.103 N,123 29.844 E)的表层沉积物柱状样品( 0-10cm),根据层次不同依次编号: 131, 132, 133, 134(取样深度分别为水 -沉积物界面以下 03cm, 35cm, 58cm, 810cm),船上 -20冰箱保存,回实验室后进行样品分装,将样品分装为 5ml( 2 管)和 10ml( 1 管)冻存管,然后在 -72超低温冰箱中保存,以备后续

14、实验使用。 图 1 样品采集地点图 Fig.1 Sampling locations map 1.1.2 主要生 化试剂(盒) 土壤核酸快速提取试剂盒 美国 MP Biomedicals 公司 琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒 天根生化科技(北京)有限公司 TaKaRa pMD19-T Vector 试剂盒 宝生物工程(大连)有限公司 TaKaRa Taq 宝生物工程(大连)有限公司 TaKaRa Premix Ex taq 宝生物工程(大连)有限公司 DL2000 DNA marker 宝生物工程(大连)有限公司 DH5感受态细胞 天根生化科技(北京)有限公司 4 引物 上海生工科技公司 1.

15、1.3 主要试剂及培养基配制 * 50 TAE 的配制( 1L) Tris 242g 冰醋酸 57.1ml EDTA( 0.5mol/L,pH=8.0) 100ml 使用前 50 倍稀释为 1 TAE,即可用于琼脂糖凝胶的配制和电泳。 * 6甘油上样缓冲液的配制( 100ml) 甘油 50ml 1%溴酚蓝 5ml EDTA 30mmol 使用前取 1ml 该溶液,按 1:2000 的比例加入 0.5 l SYBR Green I( invitrogen)核酸染料。 * LB 培养基( 1L, pH=7.5) Trypetone 10g Yeast Extract 5g NaCl 10g 向液体

16、培养基中加入 15g/L 琼脂粉即为固体培养基;向培养基中加入 300 l 20%( 200mg/ml)氨苄青霉素即为 Amp 抗性培养基。 * X-gal贮液 将 X-gal 粉末溶解于二甲基亚砜( DMSO)中,配成 20mg/mL 的贮液,分装后避光保存于 -20以备使用,无须过滤或灭菌。 * IPTG 溶液 将 IPTG 粉末溶于无菌水中,配成 200mg/mL 的溶液,分装后保存于 -20以备使用,无须过滤或灭菌。 * 丙烯酰胺( 40%, 37.5:1) 将 38.96g 的丙烯酰胺,以及 1.03g 的甲叉双丙烯酰胺溶于双蒸水中,定容到100ml,过滤后备用。 * 固定液( 10

17、%乙酸, 30%乙醇) 将 100ml乙酸, 300ml乙醇用双蒸水定容到 1000ml。 * 敏化液( 30%乙醇) 将 300ml乙醇用双蒸水定容到 1000ml。 5 * 银染液( 0.1%AgNO3)(新鲜配制) 先配制 20%母液,将 2g AgNO3 溶解于双蒸水中,定容到 10ml,放置于棕色瓶中密闭保存。每次使用时,取 2ml 母液,稀释到 400ml,再加入 400l 福尔马林溶液( 37%甲醛)。 * 显影液 溶液 1:溶解 2gNa2S2O3 于双蒸水中,定容到 10ml。 溶液 2:溶解 10mlNa2CO3 于双蒸水中,定容到 400ml。 使用时,将 400l溶液

18、1 加入到溶液 2 中,再加入 400l的福尔马林溶液。 * 终止液 溶解 5.84g EDTA2Na2H2O 以及 8g 甘氨酸于双蒸水中,定容到 400ml。 1.1.4 实验仪器 快速核酸提取仪 Fast Prep 24( MP Biomedicals, US) PCR 仪 T-Gradient( Biometra, Germany) 冷冻离心机 艾本德中国有限公司 Eppendorf 5417R 移液器 艾本德中国有限公司 电泳仪 北京市六一仪器厂 DYY-6C 型 超净工作台 苏州市洁净技术设计所 SW-CJ-IFD 型 电热恒温振荡水槽 上海精宏实验设备有限公司 DK2-2 型 台式恒温震荡培养箱 江苏太仓培英一起有限公司 HZP-250 型 电热恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司 DNP-9272 型 隔水式恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司 GNP-9160 型 超低温冰箱 日本三洋 SANYO, MDF-382E 高压蒸汽灭菌锅 上海博迅实业有限公司医疗设备 YXQ-LS-S 凝胶成像系统 GD 2000( BIO-RAD, USA) 冰箱 西门子(中国)有限公司 BCD-226 1.2 实验方法 1.2.1 样品处理 分装 13#站点的沉积物并命名。 命名: 03cm 层次为 13 1 35cm 层次为 13 2 58cm 层次为 13 3

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