食品科学与工程毕业论文：鳕鱼皮复合肽螯合钙的制备工艺.doc

1、 本科毕业论文 （ 20 届） 鳕鱼皮复合肽螯合钙的制备工艺 所在学院 专业班级 食品科学与工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 2 摘要 本文以鳕鱼皮为原料，采用了木瓜蛋白酶和风味酶构成的复合酶对鳕鱼皮进行水解获得复合氨基酸水解液，然后以氯化钙为钙源，与复合 氨基酸水解液液进行螯合反应制备氨基酸螯合钙，对螯合工艺进行了初步研究。在单因素实验的基础上，采用正交实验法研究了水解度（ DH）值、 pH值、螯合温度、螯合时间、配位比等重要因子对螯合率的影响。结果表明：在 DH 为 5%， pH 为 8，螯合时间 30min，氨基酸和氯化钙配位比为 2： 1，室温情况下，鳕鱼皮复合肽

2、螯合钙的螯合率最高，为 75.7%。 关键词 鳕鱼皮；水解；氨基酸螯合钙 Abstract In this paper,we based on cod skin as raw materials,Adopted papain 3 and flavor of the enzyme constitute compound enzyme hydrolysis of cod leather get composite amino acids hydrolysate,and then with calcium chloride for source of calcium ,And the compoun

3、d amino acids hydrolysate fluid chelating reaction chelating calcium, preparation of amino acid,in order to explore Chelation process of a preliminary study.In the single factor experimental basis,we take the orthogonal tests of the DH values, pH, temperature, chelate, chelating time, the complex ra

4、tio and other important factors on the rate of chelation. The results showed that: in the DH is 5%, PH 8, chelating time 30min, amino acids and calcium chloride complex ratio of 2:1, under the room temperature, the rate of chelation of cod skin composite peptide chelating calcium is to the highest r

5、ate of 75.7 %. Key words cod skin ;calcium amino acid chelate ;hydrolysis 1 前言 4 钙是人体内最重要的一种阳离子，是人体必需的营养成分，其作用除了作为机体骨骼和牙齿的成分外，还参与多种生理活动，对生物的生命活动起着极其重要的作用，尤其鸡、鸭、鹅等动物在产卵期间需要补充大量的钙。 钙有很多作用，像对心脏的保护作用，有助于血凝块的形成，预防骨质疏松，使骨头更结实，牙齿更健康等，据统计缺钙可引起 147 种疾病。 有资料显示 ,我国人民普遍缺钙。城市居民平均每日钙摄入量仅为中国营养学会推荐供给量的 45.7%,农村为 37

6、.7%。目前科学家认为钙补充剂可以通过增加骨峰值来达到补钙的目的。因此 ,补钙仍然是预防和治疗缺钙的重要方法之一。合格的钙营养强化剂需要具有钙含量高，吸收率和生物利用率高，安全无毒副作用，重金属含量不超标，水溶液呈中性。目前国内市场上钙营养强化剂从钙源组成来看主要有以无机 盐为主的产品 ,如矿产碳酸钙、化学合成碳酸钙、磷酸氢钙、氯化钙等，以普通有机盐为主的产品 ,如乳酸钙、醋酸钙、葡萄糖钙、柠檬酸钙以及马来酸钙等，这两类钙添加剂吸收率低，生物利用率低，有一定的毒副作用，人体会产生一定的拮抗作用。还有一种钙添加剂就是具有生物活性的氨基酸钙。氨基酸螯合钙，是由氨基酸基团与钙离子发生螯合反应生成的化

7、合物，这类化合物具有环状结构，化学性良好，生化性稳定，生物利用率高，在补充钙的同时还能补充氨基酸。 氨基酸螯合钙作为新一代钙营养强化剂 ,它具有化学性能稳定 ,生物利用率高 ,无毒、无刺 激作用 ,适合生物等优点 ,将氨基酸螯合钙作为饲料添加剂可以达到钙、氨基酸双重补充的作用大大降低了饲料消耗，提高了利用率，降低了生物体内拮抗作用的影响，是理想的生物钙营养强化剂。鲟鱼皮中氨基酸含量丰富，每 100g鳕鱼皮中含有蛋白质 20.4g，氨基酸比例易于生物吸收 ,适合利用鲟鱼加工过程废弃鱼皮复合氨基酸开发深加工复合氨基酸螯合物。本文通过以鳕鱼皮为原料，水解，将酶解液中的氨基酸和钙离子结合，对螯合钙的工

8、艺条件进行研究，在单因素实验的基础上进行正交实验确定工艺的最佳条件。 2 实验材料、主要仪器与试剂 2.1 实 验材料 鳕鱼皮 2.2 主要仪器 仪器名称 型号 厂家 电热恒温水浴锅 HHS 型 上海棱光技术有限公司 台式电子天平 TD3102 余姚金诺天平仪器有限公司 高速冷冻离心机 CR21G 日本日立公司 PH 计 DECTA320A/C 梅特勒托利多公司 恒温磁力搅拌器 85-1 国华电器有限公司 电热恒温鼓风干燥箱 DHG-9140A 上海博讯实业有限公司 2.3 主要试剂 试剂 纯度 产地 木瓜蛋白酶 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 5 风味酶 酶活力 20000IU/g 广西南

9、宁庞博生物工程有限公司 氯化钙 97.0% 上海总兴化工有限公司 乙二胺四乙酸二钠 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 氯化铵 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 乙二胺四乙酸镁 二钠盐 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 铬黑 T 分析纯 上海试剂总厂 盐酸羟胺 分析纯 国药集团化学试剂有限公司 乙醇 95.0% 国药集团化学试剂有限公司 浓氨水 25%-28% 国药集团化学试剂有限公司 盐酸 36.0-38.0% 国药集团化学试剂有限公司 氢氧化钠 96.0% 国药集团化学试剂有限公司 3 实验方法 3.1 分析方法 3.1.1 水解度 (DH)测定 DH(%)= 已水解的肽键数 / 原料中总肽

10、键数 100=(B C)/(A C)100 A：原料中总氨基氮数 B：水解液中的氨基氮数 C：原料游离的氨基氮数 水解蛋白质的 -NH2基含量测定：甲醛固定法。 3.1.2 螯合率及螯合产物总量的计算 样品中钙元素总量计算 :从初制得的螯合产物 (m， g)中称取一定量（ m1， g）作为样品，滴定其中的钙元素总量（ m2， g）。 样品中钙元素总量可由公式计算 m2=CV010-3M14 m2：样品中金属元素总量 (g) C：标准 EDTA 溶液的浓度 (mol/L) V0：滴定金属元素总量所消耗的 EDTA 溶 液的体积 (mL) M1：金属元素的摩尔质量 (g/mol) 4：稀释倍数 螯

11、合率计算：从初制得的螯合产物 (m， g)中称取一定量（ m1， g）作为样品，纯化后滴定螯合态金属元素的含量，由公式计算出产物的螯合率。 螯合态金属元素的含量 CV1 V1 螯合率 ( )=100= 100= 100 金属元素总量 CV0 V0 C：标准 EDTA溶液的浓度 (mol/L) V1：滴定螯合态金属元素所消耗的 EDTA溶液的体积 (mL) V0：滴定金属元素总量所消耗的 EDTA 溶液的体积 (mL) 游离态钙含量的测定按照 GB6226-86 EDTA 络合滴定法标准执行。 3.2 鳕鱼皮复合肽螯合钙的制备 3.2.1 鳕鱼皮复合肽螯合钙的制备工艺 脱脂 6 鳕鱼皮 酶解 测

12、水解度 按比例加入氯化钙 搅拌 调节 pH 震荡合 不脱脂 成 离心分离 95% 乙醇洗涤 分级沉淀 抽滤 鼓风干燥 鳕鱼皮复合肽螯合钙 4 实验结果与分析 4.1 鳕鱼皮复合酶解条件的确定 采用由风味酶和木瓜蛋白酶构成的复合酶对鳕鱼皮进行水解，以蛋白质水解度为考察指标。 (见表 1) 表 1 复合酶水解鳕鱼皮正交实验 试验处理 蛋白用量 /g 酶浓度 /103 IU /100ml 温度 / pH 水解度 /% 1 2.8 60 45 6 9.5 2 2.8 120 50 6.5 15.4 3 2.8 180 55 7 19.4 4 2.8 240 60 7.5 17.3 5 5.6 60 5

13、0 7 8.1 6 5.6 120 45 7.5 12.2 7 5.6 180 60 6 7.8 8 5.6 240 55 6.5 15.9 9 4.2 60 55 7.5 14.2 10 4.2 120 60 7 14.4 11 4.2 180 45 6.5 13.1 12 4.2 240 50 6 15.2 13 3.3 60 60 6.5 9.4 14 3.3 120 55 6 18.1 15 3.3 180 50 7.5 18.0 16 3.3 240 45 7 21.3 均值 1 15.4 10.3 14.0 12.6 均值 2 11.0 15.0 14.2 13.4 均值 3 14

14、.2 14.6 16.9 15.8 均值 4 16.7 17.4 12.2 15.4 R 5.7 7.1 4.7 2.8 注：水解时间因素为 120min， 均值 1 均值 2 均值 3 均值 4 代表平均值， R 代表极差。 表 1 是由风味酶和木瓜蛋白 酶构成的复合酶对鳕鱼皮蛋白质水解情况。从表中我们可以看出极差最大的是酶活力，为 7.1；其次的是蛋白用量，极差为 5.7；极差第 3 大是温度，为 4.7；极差最小的是 pH，为 2.8.各因素对鳕鱼皮蛋白质水解程度为酶浓度 底物浓度 温度 pH。我们还可以看出，对于蛋白用量因素来说， 均值 4均值 1 均值 3均值 2，也就是说当蛋白用量

15、为 3.3 时，水解程度最高；对于酶浓度因素来说， 均值 4均值 2 均值 3均值1，也就是说当酶浓度为 240103/100mL 时，水解程度最高；对于温度因素来说， 均值 3均值 2均值 1均值 4，也就是说当温度为 55 时，水解程度最高；对于 pH 因素来说，均值 3均值 4均值 2均值 1，也就是说当 pH 值为 7 时，水解程度最高。鳕鱼皮复合酶解最7 佳条件为：蛋白用量为 3.3g，酶浓度为 240103/100mL， 温度为 55 ， pH值为 7，这个条件下水解程度最高。 表 2 鳕鱼皮蛋白水解曲线方程 鳕鱼皮 拟合的进程曲线方程 相关系数（ R2） 不脱脂 DH=3.566

16、4ln(X)+1.4362 0.9890 脱脂 DH=0.7993(X)+0.8957 0.9879 鳕鱼皮是否脱脂会对水解结果造 成一定影响。以木瓜蛋白酶和风味酶构成的复合酶对鳕鱼皮进行水解，发现脱脂鳕鱼皮蛋白水解曲线为典型线性关系曲线（见图 1），而不脱脂鳕鱼皮进程曲线为对数函数曲线（见图 2），说明鳕鱼皮脱脂与否对水解进程有显著影响。螯合反应只需要考虑水解度大小，所以鳕鱼皮脱脂与否对螯合反应没有影响。从图中我们可以看出，未脱脂鳕鱼皮可以更快的获得 DH小于 10%的水解产物，脱脂鳕鱼皮可以更快的获得 DH大于 10%的水解产物。所以实验所需 DH5%、 10%用未脱脂鳕鱼皮， DH20%

17、用脱脂鳕鱼皮。 图 1 未脱脂鳕鱼皮水解进程 图 2 脱脂 鳕鱼皮水解进程 4.2 反应温度对螯合反应的影响 当 pH、水解度、反应时间、配位比一定时，选取螯合温度 10 、 20 、 30 、 40 、8 50 进行对照实验（见表 3）。温度为 10 ，螯合率为 68.2%；温度为 20 ，螯合率为 70.1%；温度为 30 ，螯合率为 71.4%；温度为 40 ，螯合率为 70.2%；温度为 50 ，螯合率为 69.4%。可以看出，不同温度下螯合率都在 70%左右，相差不大，说明反应温度对螯合反应影响不大。所以一般实验可以采取室温情况下进行。不考虑 50 以上的温度是因为，在温度大于 50

18、 时，蛋白质容易受高温影响导致蛋白质变性，造成实验误差。 表 3 温度对螯合反应的影响 温度（ ） 10 20 30 40 50 螯合率（ %） 68.2 70.1 71.4 70.2 69.4 4.3 水解度 对螯合反应的影响 当 pH、反应温度、反应时间、配位比一定时，选取 DH5%、 10%、 15%、 20%进行对照实验，实验结果见图 3. 0204060805 10 15 20水解度（% ）螯合率（%）图 3 水解度对螯合反应的影响 图 3表明，在相同条件下，水解度对 螯合反应的影响呈 U型，螯合率随着水解度的升高先降低后上升， DH为 5%时，螯合率最高，为 75.1%； DH为

19、10%时，螯合率为 69.6%； DH为15%时，螯合率最低，为 62.5%； DH为 20%，螯合率为 67.5%。 DH为 5%时，氨基酸肽链长度与钙离子大小正好达到最大匹和度，所以螯合率最高。当 DH升高时，氨基酸利用率下降，所以螯合率降低。 4.4 pH值 对螯合反应的影响 当 DH、反应温度、反应时间、配位比一定时，选取 pH3、 4、 5、 6、 7、 8、 9进行对照实验，实验结果见图 2。 从图中我们可以看 出， pH对螯合反应的影响呈倒 U型， pH为 3时，螯合率为 47.3%； pH为 4时，螯合率为 55.1%； pH为 5时，螯合率为 62.8%； pH为 6时，螯合

20、率为 67.3%； pH为 7时；螯合率最高，为 75.0%； pH为 8时，螯合率为 73.8%； pH为 9时，螯合率为 65.0%.pH从 7到 1，7到 14，螯合率都呈下降趋势。过酸性环境下， H离子会与电子基团结合，影响氨基酸螯合钙的合成。过碱性环境下，羟基会与钙离子生成沉淀，影响氨基酸螯合钙的合成。所以过酸性和过碱性环境下都不适合或获得高螯合率。 9 0204060803 4 5 6 7 8 9pH 值螯合率（%）图 4 pH对螯合反应的影响 4.5 反应时间 对螯合反应的影响 当 DH、反应温度、 pH值、配位比一定时，选取反应时间 15分钟、 30分钟、 60分钟、120分钟

21、进行对照实验（见表 3）。反应时间为 15分钟时，螯合率为 74.5%；反应时间为 30分钟时，螯合率为 75.1%；反应时间为 60分钟时，螯合率为 75.3%；反应时间为 120分钟时，螯合率为 76.1%。随着反应时间的增加，螯合率的增加不是很明显，说明反应时间对螯合反应影响不大。 表 3 时间对螯合反应的影响 时间（ min） 15 30 60 120 螯合率（ %） 74.5 75.1 75.3 76.1 4.6 配位比 对螯合反应的影响 当 DH、反应温度、 pH值、反应时间一定时，选取氨基酸和氯化钙配位比 1： 1、 2： 1、3： 1、 4： 1、 5： 1、 6： 1进行对照

22、实验。实验结果见图 3。 从图中我们可以看出氨基酸和氯化钙配位比对螯合反应的影响呈倒 U行，当氨基酸和氯化钙配位比为 1： 1时，螯合率为 65.0%；配位比为 2： 1时，螯合反应的螯合率最高，为 75%；配位比为 3： 1时，螯合率为 71.1%；配位比为 4： 1时，螯合率为 66.4%；配位比为 5： 1时，螯合率为 62.8%；配位比为 6： 1时，螯合率 58.6%。氨基酸含量增多，会使氨基酸利用率降低，影响螯合反应；当配位比为 1： 1时，氨基酸太少也影响氨基酸螯合；配位比为 2： 1，氨基酸含量与钙离子达到最大匹和度，螯合率最高。 0204060801:1 2:1 3:1 4:

23、1 5:1 6:1氨基酸和氯化钙配位比螯合率（%）10 图 5 配位比对螯合反应的影响 4.7 螯合反应最佳工艺条件确定 在单因素试验的基础上， 以 50 mL 的复合氨基酸水解液为反应基准，选取 pH 值（ A）、水解 度（ B）、反应时间（ C）、复合氨基酸与氯化钙配位比（ D） 4 因素，采用 L9(34)正交试验设计，以复合氨基酸螯合钙的螯合率为指标，进行螯合工艺的研究，对制备复合肽螯合钙的工艺条件进行优化（见表 4），得到最佳工艺条件。 表 4 因素水平表 A螯合体系 pH值 B酶解液水解度(%) C反应时间（ min） D复合氨基酸与氯化钙配位比 6 5 15 1： 1 7 10

24、30 2： 1 8 20 60 3： 1 4因素 3水平螯合反应的正交试验结果（见表 5）。 表 5 螯合反应正交实验结果分析 项目 因素水平 螯合率（ %） A B C D 1 1 1 1 1 58.1 2 1 2 2 2 61.4 3 1 3 3 3 41.8 4 2 1 2 3 65.7 5 2 2 3 1 57.4 6 2 3 1 2 50.6 7 3 1 3 2 69.1 8 3 2 1 3 59.4 9 3 3 2 1 51.5 均值 1 53.8 64.3 56.0 55.7 均值 2 57.9 59.4 59.5 60.4 均值 3 60.0 48.0 56.1 55.6 R 6.2 16.3 3.5 4.8 注：螯合时温度因子为常温，均值 1、均值 2、均值 3 代表平均值， R 代表极差。 表 5是鳕鱼皮复合肽螯合反应正交实验，从表中我们可以看出水解度的极差值最大，为16.3；第二大的是 pH值，为 6.2；接下来是氨基酸与氯化钙的配位比，为 4.8；最小的是时间，