1、Western Blot 原理和操作方法（详细）$5V 工作原理 Y|-_-2IU 蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100g),分辨率高,可检出 10-9-10-12mol的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用. -O?Q%9v SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于
2、蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量. 和 C%=a/(a+b)*100% b=单体(arc)的重量 ;m=溶液的体积(ml) uUo!kl H L0#p36e 当分析一个未知样品时,常常先用 7.5%的标准凝胶制成 4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度: RKB6 细胞培养至 80%左右密度时，细胞经预冷的 PBS漂洗 3次，加入 450l 裂解液，细胞刮刀收集，用移液器转移至离心管中，反复吹打。 jkR!:R;iC 手术切除的组织块迅速置于预冷的 0.95生理盐水中，漂洗数次，以清洁表面的血迹，将组织称量后切成几个较小的组织块放入
3、机戒组织匀浆器中，按组织净重，裂解液=1：10 的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆，离心收集上清（如有粘稠物可超声处理，具体方法见细胞培养的样品制备，也可以冷冻干燥降解核酸后，将冻干的蛋白质样品溶解在适当的上样 buffer中，混匀后静置 3小时使样品中的蛋白质充分的溶解，有 5分钟即可，4 度离心收集。）加入 Laemmli样品缓冲液（视蛋白样品浓度，以 1：1 或 1：2 的比例混合）强力混匀，样品置 100度的水浴箱水浴加热 3-5分钟，10000g 离心 10分钟，取上清液，将其转入另一洁净的试管中，至此，电泳样品已准备就绪（样品即可立即使用也可也可以分装冻存，-20存放的样品可稳定
4、保持数月。） YV, QiTZ #mLqr5 附： SKe2x 0 一：裂解液的制备： vV|Yw1 组织裂解液（全细胞蛋提取）：1：Tris-HCL 50mmoL/L PH 7.4 !: 1fL5 6： PMSF 1 mmoL/L goG:W 7： Aprotinin 1g/ml yCxV6 8: leupeptin 1g/ml zkCJTa#pt 9: pepstain 1g/ml 79 f|k= 其中:7,8,9 作用不持久，要使用前加入。 #Gl-6 d“ajdj 50 mmoL/L Tris(PH8.0) IJquXhc 2：RIPA 裂解体系：150 mmoL/L Nacl IOo
5、sZZ+5 1.0%NP-40或 Triton-x-100 fh? 6+ 0.5%脱氧胆酸钠 (ca1 )YBBP 50 mmoL/L Tris( ph8.0) r xbL 4z!%Pfoep 二：Laemmli 样品缓冲液配置（1*SDS 样品缓冲液） bohC“EK 50 mmoL/L Tris-HCL （PH8.0） W-Tw8F 100 mmoL/L DTT BGDu. K 2% SDS ,nh?6 0.1% 溴酚蓝 9v,hI ?G0 10% 甘油 qBq!oV 此液可以配置成不同的储存液，根据蛋白浓度而定，40C 长期保存，用时临时与蛋白液按比例混合，其中 DTT应临时加入，以防降
6、解。 -NBf8 蛋白质定量 Vj/ 76Ab= ,?WA.D 1)Bradford法: e0z.9SB 检测原理: Bradford 与蛋白质四级结构,特殊氨基酸结合,由棕色变成蓝色,595nm 检测.该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的,但不使用于小分子碱性多肽的定量,如核糖核酸酶或溶菌酶,去污剂的浓度超过 0.2%影响测定结果,如 TritonX-100,SDS,NP-40等. n I$k5G Bradford 法浓染液的配制:将 100mg考马斯亮蓝 G-250溶于 50ml 95%乙醇,加入 100ml浓磷酸;然后,用蒸馏水补充至 200ml;此染液放 4至少 6个月保持稳定.
7、;_,(h5 标准曲线蛋白质样本的制备:尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品,例如测定抗体,可用纯化的抗体作为标准,如果待测样品是未知的,也可用抗体作为标准蛋白,通常在20g -150g/100l 之间绘制标准曲线. e再将 1g CuSO4.5H2O和 2g酒石酸钠溶于 500ml蒸馏水中;将铜/酒石酸钠溶液放在磁力搅拌器上搅拌缓缓加碳酸钠溶液,储存于冰箱中,可稳定保存 1年以上. jKN5K9 Folin-ciocalteu 酚试剂 ? u5dyr 按体积比 1:2:1将铜/酒石酸/碳酸钠,5%SDS 和 0.8mmol/l NaOH溶液混合,室温下储藏,可稳定保存 2周,标明为试
8、剂 A e 9P#r 按体积比 1:5将 Folin-ciocalteu酚试剂和 H2O混合,室温下储存于琥珀色试剂瓶中,可稳定保存 1个月,表明为时机 B -hF:Wb% 用蒸馏水将样本(5-100g)稀释为 1ml,并准备 100,50,25,12.5g /ml,4 个浓度的 BSA作为标准蛋白. 2dp8UP 每个蛋白样品家 1.0ml试剂 A,混合均匀,在室温下孵育 10分钟. 4-2wwNS 加入 0.5 ml试剂 B并立即混合, 在室温下孵育 30分钟. 0X+=tdj 电泳装置（垂直板电泳槽）为北京六一仪器厂生产的 DYCZ-24D型电泳装置。 fY v5RT 电泳仪（电源）为北京六一仪器厂生产的 DYY-8B型。 SDS 9w* pK TEMED -,?N=XZ Tris vJfH9j 过硫酸铵 8k4Ke t) -巯基乙醇或 DTT 1“T/f6$YNc 甘油 moDVP7x 甘氨酸 KWg7#a 溴酚蓝 rboAsf
