§1 微生物生长与调节.doc

1、1 1 微生物生长与调节 1.1 微生物的生长活细胞最基本的生命特征是生长和繁殖。关于生长的定义，不同学科的学者有不同的见解。细胞生物学家关注单细胞的形态变化，特别是细胞的分裂方式。生化学者对成千上万个与生长有关的酶反应动力学及代谢途径感兴趣，认为生长是所有化学成分有秩序地相互作用的结果。生物物理学家则认为，细胞是热力学不平衡的开放系统，与其周围环境进行物质与能量的交流，特别表现在熵的溢流上。生化工程师把生长看做是生物催化剂数量的增长，通常以质量和细胞数目的增长来表达细胞的生长。分化（differentiation）则是生物的细胞形态和功能向不同的方向发展，由一般变为特殊的现象。一、生长的形式

2、1、细菌的生长裂殖、细胞壁合成方式（G +菌沿着中纬带；G -菌沿着整个细胞壁，以居间并生方式合成的） 、菌龄（一般以培养时间表示，真实菌龄应以繁殖的代数表示） 。2、酵母的生长芽殖（按芽痕出现位置芽殖分两类：两极性与多极性） 、菌龄（由芽痕数量确定） 、假菌丝（子细胞不与母细胞分离，形成链状） 、胞内膜系统（把细胞分隔成几个能就地进行高效生化反应的间室，并建立了输送适当材料到各间室的系统） 、泡囊运输（一种连接细胞中大多数主要细胞器的投递系统，高尔基体占据了内质网与核内体、液泡和质膜之间的交通中心位置：待分泌蛋白质从内质网被集中于外衣的 COP泡囊，然后输送到早期高尔基体间室，在那里被修饰、

3、分类和输送到其最终目的地。可溶性蛋白与膜蛋白通过其固有的固位机制维持其适当的定位作用。这类固位机制部分涉及蛋白-蛋白的相互作用与逆行输送到罩上外衣的 COP光囊处） 。3、霉菌和放线菌菌丝的生长生长方式（菌丝末梢伸长、分枝或交错成网，称为菌丝体） 、分生孢子（真菌形成） 、菌丝长度（受遗传控制并与生长环境有关） 、菌丝团（以产黄青霉为例，其密实程度受搅拌、供氧和温度等培养条件的影响，特别与碳源的性质有关。菌丝团变得密实的条件有：添加易利用的碳源，如葡萄糖；搅拌加快；供氧改善。反之，用乳糖、搅拌缓慢或供氧不善，则菌丝团变得疏松。菌丝团内部营养物质的缺乏与代谢产物的积累会使菌的生长处于不利环境之中

4、。 ）24、细胞群体的生长倍增时间（以 td 表示） 、比生长速率（ =ln2/td=0.693/ td） 。5、细菌群体的生长周期停滞期通常地，从不太能满足需求的培养基移种到能满足需求的培养基其停滞期缩短；相反如培养物从丰富培养基移种到贫乏的培养基，停滞期一般会延长，这是由于受丰富培养基组分阻遏的生物合成必需重新启动后生长才能恢复。但这种情况对自养菌不适用，因复合有机养分会抑制其生长。指数（对数）生长期通常，在补充有机碳源，特别是葡萄糖的矿物盐培养基中的生长比其他碳源快些。对兼性厌氧菌来说，有氧下的生长通常比无氧快些，这反映出在有氧条件下微生物合成 ATP 的效率更高。生长在需要花费更多能量

5、来同化的基质中（如硝酸盐）比花费能量少的（如氨）通常要慢些。温度、pH 和渗透压等环境条件对生长也有影响。静止期一种情况，待主要或必需养分耗竭，生长也就中止。在含碳-能源有限的合成培养基中从指数生长期转到静止期是突然的，但对生长在复合培养基的培养物则其过渡时间较长，一些辅助的碳基质（主要是氨基酸）先后耗竭。进入静止期常出现很大的代谢变化：对产芽孢的细菌（如枯草芽孢杆菌，某些养分的耗竭启动相继的形态变化，在母细胞内形成高度稳定的休眠芽孢） 、对不产芽孢的细菌（DNA 再合成一段时间后细胞净重的增加停止，细胞分裂后子细胞个体变小，其 RNA 含量低。在静止期合成许多蛋白质，包括胞外酶。若生长受外源

6、碳基质或可利用氮源缺少的限制，便不能形成 RNA 与蛋白质合成所需的中间体。但是，饥饿单细胞通常能从非必需的 RNA 和蛋白质的水解产物中获得中间体，这是随饥饿开始，胞内核酸酶和蛋白酶的作用所致。这种循环被称为周转（turnover） ，是一种能使细胞存活和适应环境改变的重要特性。 ）另一种情况，静止期的出现也不总是必需养分缺乏的缘故。生长通常伴随 pH 改变，有时这一改变也会抑制细胞的进一步合成。即使生长在中性糖中且产生唯一的分解代谢终产物 CO2，也可能引进 pH 的显著移动。这可能是由于阳离子（ NH4+、K +和 Mg2+）与阴离子（SO 42-、PO 43-）的吸收比例失调。例如，枯

7、草芽孢杆菌可能含有占干物质 12%的氮和 5%的钾，而细胞的磷和硫含量分别为细胞干重的 3.5%和 0.5%，因此被同化的 NH4+、K +与 SO42-、PO 43-的分子比为 7，其电荷比为2.5。在革兰氏阴性菌中也存在类似的不平衡，尽管细胞对钾和磷的需求低许多。细胞生长在葡萄糖为唯一碳源中会使培养液 pH 不断下降；相反，生长在乙酸盐、乳酸盐或琥珀酸盐中会使 pH 升高，这是由于阴离子的消耗比阳离子多所致，生长常因 pH 升高而停止。3二、生长的测量菌浓 X（在线与离线测量） 、产物浓度 P、比生产速率 Q（表征菌的生产能力） 。1、细胞数目的测量可用方法：直接显微计数、平板活菌计数、载

8、片培养计数、微孔过滤法、库尔特计数器、流动式细胞光度计、表荧光滤光技术、荧光-抗体技术、微型 ELISA 和电子显微镜。2、细胞量的测定方法：干重（DCW）法、比浊法、离心压缩细胞体积（ PCV）法、成像分析法。3、菌浓的间接测量用于估算菌浓的间接方法：细胞组分（核酸、蛋白质、细胞 C 或 PO43-、多糖、脂质、ATP） 、代谢活动、基于数学模型的细胞量测量方法（有时被称为“软件化传感器” ） 、化学计量法。核酸 核酸通常存在于所有活体细胞中，可作为菌量的度量。但此法不能区分细菌与真菌的菌量。核酸的测定方法相当精确，但也存在系统误差。细胞中的核苷酸与肽具有同样的颜色反应和吸收光谱，对核酸测定

9、有干扰作用。用于测量生长的这些参数需先进行生物标定，因细胞组分随时间变化，并取决于营养与生理因素。单个细胞的 DNA 随生长速率而变化。生长快的细胞由于具有较多的复制叉，DNA 含量较高。但按单位质量细胞计算的 DNA 含量变化较小。故 DNA 可用于表征生物量的变化。问题是细胞中一般只含 1%3%的 DNA，其测定易受 RNA（含量约为 7%25%）干扰。测定 DNA 常用的方法有二苯胺法和溴化乙锭法两种。培养基中不溶性非细胞蛋白对 DNA 分析无干扰。蛋白质蛋白质含量通常随生长速率的变化不大，因而可作为细胞量的常规度量。主要的应用限制是培养基成分中不能含有非细胞性和水不溶性的蛋白质。常用方

10、法有双缩脲法、Lowry 法和凯氏定氮法。ATP方法：利用萤火虫荧光素酶催化 ATP 与荧光素反应生成腺苷酰荧光素，后者被氧氧化后发光，每水解 1 分子 ATP 可得 1 光量子，可用荧光光度计测量。代谢活动在对数生长期 CO2 的释放在一定条件下与细胞量成正比。监测 CO2 的生成是跟踪生长活动的有效方法。最常用的是红外分析仪和质谱仪，均可连接多个发酵罐。计算 CO2 释放速率 CER 的公式为：4)( inpiinpoutptoutpVFCER owcwccn 式中：F n 为 N2 流速，mol/min；V 为液体体积，L；p 为总压力， Pa。用 CO2 生成速率监测生长，无需用无菌取

11、样便能精确测定排气中的 CO2 含量。单位细胞量生成的 CO2 取决于分解代谢途径及产能分解代谢与耗能合成代谢耦合的效率。对于许多好气或厌氧发酵，上述因素几乎不变。在产黄青霉生长期间 CO2 生成速率是细胞生长的指标。CO 2 是分解代谢的最终产物，它与 ATP 的生成有关。若每 mol ATP 所产生的细胞量是恒定的，且 ATP 以恒定速率合成，则 CO2 的生成速率与细胞的生长成正比关系，确切的比例取决于 ATP 的产生途径，如在好气条件下则取决于末端氧化的电子传递速率；若生长与分解代谢未耦合（如静息细胞代谢） ，则这种相关性便不成立。氧吸收的测量也可以作为细胞活性的度量。活菌的氧吸收速率

12、相当稳定。所以，氧的吸收可与生物量关联，条件是未出现主要的生理变化，如对新能源的适应。在不同碳源上生长的酵母，其氧吸收速率可作为代谢活动的指示。在好气培养中热的释放速率与氧细胞得率（形成单位细胞量的氧的吸收）的关联较好。4、生物量的在线测量生物量的在线估算方法：微量热计、荧光、电容/电导/ 阻抗、自动化方法和分光光度计。微量热法在发酵过程中热的输入与输出关系由下式表达：Qacc= Qf + Qag-Qe-Qs-Qcond-Qcool式中：Q acc 为热的积累；Q f、Q ag 分别为发酵热和搅拌热；Q e、Q s 分别为蒸发损失和空气显热损失；Q cond 为导热损失=（T 0-Tf）uA；

13、Q cool 为冷却系统的热损失（=WC PT） 。有两种方法可从上求得发酵热：第一种稳态热平衡法，在热的积累 Qacc=0 时：Qf=Qag-Qe-Qs-Qcond-Qcool=WCPT+(T 0-Tf)uA+FCP,airT air+FH-KN m第二种测量发酵热的方法是动态法，当 Qcool =0 时：Qf=Qacc+Qe+Qs+Qcond-Qag= MCPT/t+(T 0-Tf)uA+FCP,airT air+FH-KN m关闭冷却水后，测量温度随时间的变化T/t，由上式即可求得 Qf。培养物荧光 荧光主要来自胞内 NADH 和 NADPH。电容、电导和阻抗自动化方法5光谱学三、环境对

14、生长的影响1、物理环境温度；机械的影响；渗透压对生长的影响；水分活度。2、化学环境pH 的影响；溶氧的影响； 二氧化碳的影响；碳源的影响；氮源的影响；烷醇的影响；有机酸的影响。四、生长的变量和约束1、细胞的大分子成分2、限制步骤3、生长对能量的需求4、微生物热的生成 1.2 细胞周期一、染色体复制与细胞分裂的调节染色体复制和细胞分裂的调节规律：染色体复制未完成，细胞就不会分裂，无论生长速率快或慢，大肠杆菌的细胞分裂总是出现在染色体复制完成之后；不同的生长速率下 C 和 D 所需时间大致不变；C 和 D 可以依次或同时（指上一周期的 D 和下一）进行。二、染色体复制的启动三、细胞周期的研究方法1

15、、镜检法2、同步培养 密度梯度离心沉降法（按细胞大小或菌龄把在对数生长期的培养物分裂） 、过滤洗脱法。3、同位素示踪法4、生长速率与细胞大小的关系5、生长速率对细胞内 DNA 含量的影响6、生长速率对细胞组分的影响6 1.3 生长效率微生物细胞的生长与繁殖是其组成分子的熵的大幅度降低，由热力学第二定律可知，必然同时存在系统另一处的熵增加，其值至少等于分子形成细胞结构时的熵损失。在活体系统中熵的这种重新分布是通过把产生更高熵的反应与低熵反应耦合进行的。那些产生更为复杂（低熵）结构的反应称为合成过程；而那些产生更为简单的（高熵）分子的反应，称为分解代谢过程。微生物的生长效率因而取决于合成与分解代谢

16、的效率。但生长效率的精确定量比较困难。一、得率系数（yield coefficient）1、分子得率系数（molar yield coefficient） 适用于比较不同基质的转化率。2、碳转化效率（carbon conversion efficiency） 只适用于基质为唯一碳源的情况，对生长的能学情况提供的信息很少。3、以电子平均数为基准的得率 Yave e-（yield per average electron）4、基于热产生的得率 Ykcal（yield based on heat production ）5、以氧耗为基准的得率系数 YO（yield in terms of O2 co

17、nsumed）6、基于 ATP 消耗的得率 YATP（Yield based on ATP consumed）7、影响生长得率的因素 碳源的性质；基质的分解代谢途径；提供任何复杂基质，菌便省略若干合成途径；同化其他养分，特别是氮的能量需求；不利于离子平衡的抑制性物质或其他会对运输系统提出额外要求的培养基成分；生成 ATP 反应的效率的变化；菌的生理状态；对于连续培养，限制性基质的性质（如碳限制的生长常比氮限制的生长效率更高，过量碳基质的分解代谢可能会走浪费能量但对人有用途径） ；连续发酵允许的生长得率，在低生长速率下维持作用的重要性；微生物的遗传特性。二、测定生长效率时应注意的实际问题1、分批

18、与恒化培养2、培养基组成3、流出液的控制4、取样与代谢物的分析三、基本代谢流同化与异化由两个因素决定细胞得率生物量形成的能量需求和在异化中能量转化效率。同化过程涉及系列生物合成，导向细胞的形成。异化过程提供同化所需的能（ATP） 。细胞活动的维持和养分的运输也需要能。最后，碳流被导向 NADPH 的生成。NADPH 在组成代谢中用作还原剂，它的形成7在这里被看作是同化过程。用氧化性很高的基质，需要额外的异化流将碳源还原到生物量的水平，即提供还原当量。用于生长的碳源不一定需要与用于提供能量的碳源相同。许多微生物可以生长在混合基质上，这样用于同化碳源的 ATP，几乎只从甲酸衍生，而甲酸本身不能被同

19、化。在这些条件下碳源的得率达最大值，即碳源中的所有碳均流向细胞合成。四、对细胞得率的化学计量限制细胞得率研究的一个重要方面是研究已知碳源所能得到的理论得率的限制，通常假定此时基质完全结合到生物量中，即 100%的碳转化。在同化中 CO2 损失的大小取决于碳源，生长在葡萄糖或甲醇的损失大约 10%，琥珀酸或草酸为 29%。在估算生长得率限制时需要考虑的另一个因素是生物量的形成需要 NADPH。生长中用于同化的 NADPH 需要量取决于氮源。五、用于生物量形成的能量需求六、细胞组分七、碳源的运输碳源运输的能量需求将影响同化对 ATP 的需求和异化的 ATP 得率。1、糖的运输2、有机酸的运输八、呼

20、吸效率P/O 商是指消耗 0.5 mol 氧形成 ATP 的量。九、维持能与环境因素的关系维持能是指分解代谢产生的用于非生长活动的那部分能量，这些活动包括在分子的周转、无效（futile）循环和维持细胞体内平衡。通常可用 1/Y 对 1/D 作曲线，其中 Y 代表基于碳源、氧或ATP 的细胞得率。影响维持能的因素有：基质碳源种类；细胞组分；pH 值；温度；培养基渗透压；氧和 CO2 分压。1、渗透压2、水分活度3、氧和二氧化碳分压4、温度5、pH 值6、副产物对生长得率的影响8 1.4 生长调节微生物生长分化受其自身和外界多种因素的调节。这里以真菌对象阐述菌丝体形态调节的规律。一、菌丝顶端生长

21、1、菌丝顶端生长机制2、泡囊在菌丝顶端聚集3、菌丝生长过程二、菌丝分枝规律菌丝分枝一般在距生长着的菌丝顶端一定距离的后方进行。真菌如同高等植物那样显示出顶端生长的优势。有可能是激素在起作用维持这种优势，但从未证实过；也有可能是菌丝养分的竞争或由生长旺盛的菌丝顶端释放出某种代谢物所维持。1、分枝的形成2、菌丝生长单位三、微生物生长分化的调节真菌孢子在固体培养基上发芽，形成未分化的菌丝，继续生长、分化为成熟的菌丝。丝状菌形态上的优势在于：菌能无限扩增而无需改变细胞质的体积与表面积之比；菌丝体与培养基之间的物质交换只需通过较短的距离；菌丝以有规律的分枝确保它能高效地覆盖在固体培养基上。未分化菌丝的生

22、长调节至少包含三种机制：菌丝极化的调节；分枝启动的调节；菌丝空间分布的调节。1、极化生长的调节2、菌丝分枝启动的调节3、菌丝空间分布的调节4、链霉菌生长的调节 气生菌丝的调节；菌丝团（球）的形成。 1.5 运输过程代谢物的研究和生产往往关注微生物的生长条件，如培养基、氧的供给和细胞的代谢调节而忽略膜运输过程。一、载体的概念9载体是一种可移动的蛋白质，在某一时刻，将其一个或以上的基质结合位点暴露在膜的一侧或另一侧（但不会同时面向两侧） 。通道是指膜上的一种固定结构，充满水的通道中分子可从两个方向进出。一般，载体是不会移动的，但它们可能含有通道。二、溶质运输的机制与能学三、运输动力学证明一种载体参

23、与膜运输过程并不容易。常用动力学来揭示载体系统在运输中的作用。运输动力学与酶动力学相似之处在于：饱和动力学；基质特异性；受特殊试剂的抑制；逆流动力学的存在。四、大分子的运输 2 微生物的基础代谢微生物的新陈代谢包括细胞中的所有生物化学反应。它们均服从热力学的基本规律。在代谢过程中凡是能释放能量的物质（包括营养和细胞物质）的分解过程都被称为分解代谢；吸收能量的物质的合成过程都被称为组成（合成）代谢。只有了解微生物的基础代谢和能量转换的规律，才能有效控制微生物的生长繁殖和有用代谢产物的合成。2.1 能量代谢原理光养生物和化能营养生物；异养生物与自养生物；分解代谢与合成代谢一、能量代谢的热力学1、热

24、力学第一定律和热焓2、热力学第二定律和熵3、测定自由能的方法二、能量的产生与耦合1、能量的产生 氧化还原反应：氧化与还原；电子给体与电子受体氧化还原系统或电子载体系统，如呼吸链（其重要性在于它能把每一步取得的自由能转换为化学能而加以保存，以供给合成代谢或其他需能活动所需的能量）2、高能化合物要有效利用分解代谢释放出来的能，就必须将这些能量通过一些高能化合物以高能键的形式贮10存起来，这种化合物又称为能量载体。如 ATP、酰基磷酸酯类化合物、硫酯类化合物、无机多磷酸（盐）和羧酸衍生物等。3、能量的耦合能量耦合作用是指一种能量上可行的反应推动另一种在能量上不可行的反应进行的过程。这种作用在生命活动

25、中特别重要，它使代谢作用产生的化学能有效贮存、利用。耦合反应的类型 吸能与放能反应通过两种方式耦合，一种是有能量转移的耦合反应，如单酶催化单一反应和多酶反应；另一种是不出现真正能量转移的耦合反应，即无能量转移的耦合反应。耦合反应的机制 已知的有化学耦合、构型耦合和化学渗透耦联三种假说。4、用于细胞的能量转换分解代谢所产生的能可转换为 ATP、还原型吡啶核苷酸和离子梯度。基本上存在 3 种水平的磷酸化作用以提供细胞所需的 ATP：基质水平磷酸化（由可溶性酶催化的基团转移反应，最终导致ATP 生成） 、电子输送磷酸化（由结合在膜上的酶所催化的氧化还原反应，如呼吸链所产生的ATP）和光合磷酸化（也是

26、由结合在膜上的酶所催化的将光能转换为 ATP 的反应） 。细胞的能势可用现存的 ATP、ADP 和 AMP 之间的比例来表示，即能荷。 AMPDT5.0能 荷能荷有助于监测一已知细胞生长期间的能量变化及其酶活的相应变化。细胞生长旺盛时，ATP合成出来后随即被迅速利用，因而其能荷值是最低的；在生长后期，ATP 的比例相对升高，故能荷值上升；当细胞停止生长，所有 ADP 和 AMP 被转化成 ATP 后能荷达到最大值。2.2 微生物的分解代谢概念：同化作用、化能自养菌（chemoautotrophic） 、光能利用菌（phototroph） 、异养菌（heterotroph）和营养缺陷型（auxotroph） 。一、葡萄糖分解代谢葡萄糖的分解代谢途径随菌种而异，主要有 EMP、HMP 或 HMS、ED 和 PK 四种代谢途径。前二种存在于哺乳动物、酵母和细菌中，后二者只存在于细菌中。1、EMP 途径葡萄糖+2ADP+2Pi+2NAD +2 丙酮酸+2ATP+2（NADH+H +）2、HMS 途径