微生物工程实验指导2011.doc

1、微生物工程实验指导实验一：接种工具的认识与使用 实验二：比浊法测定发酵液中大肠杆菌浓度实验三：测定菌体干重实验四：发酵过程中糖的利用实验五：淀粉产生菌的初筛实验六：淀粉酶活力的测定实验七：生产菌株发酵条件优化实验八：发酵污染的检测与判别实验九：乳酸菌的分离纯化与鉴别实验十：酸乳及酸乳饮料的制作实验十一：反应器设备的原理及使用实验十二：反应器电极的使用实验十三：抗生素产生菌初筛实验一：接种工具的认识与使用一、 实验目的1. 认识接种工具，学会使用方法，学习包扎接种针、移液管及灭菌方法。2. 学习接种的基本技能二、 实验原理接种是发酵技术的最基本操作，微生物的传代和扩大培养都需要接种或移种。接种是

2、指将微生物接到适合于其生长的营养物上使微生物繁殖的操作。移种是指将已培养好的液体培养物转接到新鲜的液体培养基中，使其进一步扩大培养和生长繁殖的操作。接种工具常用的有接种针、接种环、接种铲，移液管等。接种和移种是将已培养好的菌种转接到新鲜培养基的过程，不同的菌，采用不同的接种方法。一般细菌和酵母菌由于菌落比较湿润，容易粘附到接种工具上，因此可以用接种针或接种环接种；而放线菌和霉菌的菌落比较干燥，不容易粘附在接种工具上，因此用接种铲产起斜面表层的一块菌苔作为接种物。接种过程是一个无菌过程，接种工具、接种环、接种环境以及培养基都应该保证无菌条件。三、 试剂与器材接种针、接种环、移液管、棉花、牛皮纸、

3、试管斜面培养基、液体培养基四、 实验操作1. 认识接种针、接种环2. 接种针、接种环的包扎和灭菌3. 移液管的认识和包扎4. 接种与移种A 两斜面之间的接种方法(1)贴标签 接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。贴在距试管口约 2-3cm 的位置。(若用记号笔标记则不需标签)。(2)点燃酒精灯。(3)接种 用接种环将少许菌种移接到贴好标签的试管斜面上。操作必须按无菌操作法进行。简述如下：1)手持试管 将菌种和待接斜面的两支试管用大拇指和其他四指握在左手中，使中指位于两试管之间部位。斜面面向操作者，并使它们位于水平位置(图 2-11)。2)旋松管塞 先用有于松动棉塞或塑料管盖

4、，以便接种时拔出。3)取接种环 右手拿接种环(如握钢笔一样)，在火焰上将环端灼烧灭菌。然后将有可能伸入试管的其余部分均灼烧灭菌，重复此操作，再灼烧一次。4)拔管塞 用右手的无名指、小指和手掌边先后取下菌种管和待接试管的管塞，然后让试管口缓缓过火灭菌(切勿烧得过烫)。见图 2-12(a)所示。5)接种环冷却 将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却。6)取菌 待接种环冷却后，轻轻沾取少量菌体或胞子，然后将接种环移出菌种管，注意不要使接种环的部分碰到管壁，取出后不可使带菌接种环通过火焰。见图 2-12(b)所示。7)接种 在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面

5、试管。从斜面培养基的底部向上部作“Z”形来回密集划线，切勿划破培养基。有时也可用接种针仅在斜面培养基的中央拉一条直线作斜面接种，直线接种可观察不同菌种的生长特点。B 斜面转接摇瓶液体培养基1. 接种环接种2. 移液管接种种子培养物转接发酵摇瓶1） 用右手的无名指、小指、和手掌夹住种子瓶的棉塞，轻轻拔出，将瓶口过火后移开，但使瓶口仍靠近并面向火焰。2） 将移液管伸入种子摇瓶培养物中吸出要求量的培养物，食指按住移液管顶部，小心取出吸管。3） 用右手的无名指、小指和手掌夹住发酵摇瓶的纱布塞，轻轻拔出，将摇瓶过火后移开，但使瓶口仍靠近并面向火焰。4） 将带有菌体的移液管伸入待接种的摇瓶，放松吸管顶部，

6、接入种子液，取出移液管，放入消毒水中。5） 摇瓶口包上纱布，放恒温摇床培养。5.五、 思考题灭菌后如果比较湿对接种有没有影响，怎么办？实验二： 比浊法测定发酵液中大肠杆菌浓度一、 实验目的学会比浊法测定发酵液中以单个细胞的分离形式存在的微生物浓度的方法。二、 实验原理大肠杆菌和酵母菌等在发酵液中以单个细胞的分离形式存在的微生物可以采用测定浊度的方法确定菌浓。具体方法是将发酵液适当稀释后，使用可见分光光度计在波长 600660nm 下测量发酵液吸光度，为了保证测定的准确性，吸光度值应在 0.20.7 之间，可以通过适当稀释发酵液来实现。三、 器材与试剂培养基（g/L）：蛋白胨 10，酵母膏 10

7、，NaCl 5,pH7.2摇瓶装量 20%。37摇床恒温培养 1012h。分析测定仪器：可见分光光度计四、 实验操作1. 取 10 支试管，分别在其中加入 5ml，2.5ml，1.0ml，0.5ml，5、0.1ml大肠杆菌培养液。每支重复一次。2. 顺序在其中加入 0ml，2.5ml，4.0ml，4.5ml ，4.9ml 去离子水，分别稀释 1、2、5、10、50 倍。3. 以去离子水为参比，在波长 600nm 比色，测定吸光度值。五、 数据记录读取并记录每一次数据。稀释倍数 1 2 5 10 50A600A600稀释倍数计算：菌浓= A 600稀释倍数实验三：测定菌体干重一、 实验目的学会测

8、定菌体干重的方法，以及分析菌体干重与比浊法测定的吸光度之间的关系。二、 实验原理在不含固体的培养液中培养微生物，发酵液中的固体全市菌体，因此可以首先离心得到湿菌体后，用适当的方法干燥，得到干菌体的量可直接反映菌体生长的多少。三、 器材与试剂培养基（g/L）：蛋白胨 10，酵母膏 10，NaCl 5,pH7.2分析测定仪器：恒温干燥箱，分析天平四、 实验操作1. 将 2 个干燥的 10ml 离心试管放入 95烘箱烘 2h 取出，放入干燥器，待试管冷却后称重得到 m 空 1，m 空 22. 在两试管中分别准确加入 10ml 发酵液，注意发酵液需摇匀。3. 放入离心机离心，3000r/min，离心

9、15min，注意：离心之前要将预离心的试管平衡并对称放入离心机，以免损坏离心机。4. 同时测定该发酵液的 A600 值。5. 离心毕，拿出试管，弃去上清液，将试管和其中的菌体放入 95烘箱烘干 12h。6. 取出试管，放入干燥器，待冷却后称重，得到 m 菌 1，m 菌 2。五、 数据记录记录：m 空 1，m 空 2, m 菌 1，m 菌 2, A600计算：m 空均 =（m 空 1+ m 空 2）/2m 菌均 =（m 菌 1+ m 菌 2）/2菌体干重= m 菌均 - m 空均单位菌体干重=菌体干重1000/10（g/L）菌体干重除以 A600 即得到二者的对应关系。在测定发酵过程的菌浓变化时

10、，只要测得 A600 就可以计算出菌体干重。实验四：发酵过程中糖的利用一、 实验目的1. 了解发酵过程中碳源的利用规律。2. 掌握用邻甲基苯胺法测定糖含量的方法。二、 实验原理糖类是微生物生命活动中主要的碳源和能源物质。一方面，微生物的生长需要糖类，另一方面，糖也构成了代谢产物中碳架的主体。所以在发酵过程中，糖的消耗是一项重要的生理指标，是判断发酵进程的主要依据。糖的定量测定方法很多。如斐林试剂法、碘量法、蒽酮比色法、3,5-二硝基水杨酸法等，它们各有优缺点。本实验采用邻甲基苯胺法测定。该法的特点是反应灵敏，操作简便，结果准确，稳定性好。邻甲基苯胺是一种芳香族伯胺，可与醛基反应生成希夫碱。在酸

11、性溶液中，邻甲基苯胺与葡萄糖的醛基作用，生成葡萄胺和相应希夫碱的混合物。这一混合物呈绿色，颜色稳定，其深浅与葡萄糖的浓度呈正比，在一定范围内符合比耳-朗伯特定律，因此可用于测定还原糖的含量。三、 实验器材和试剂1. 器材721 分光光度计，移液管，容量瓶，试管等。2. 试剂（1） 标准葡萄糖溶液：取分析纯葡萄糖置于 105烘箱干燥 2h，精确称取20mg，溶解后置于 100ml 容量瓶内，用蒸馏水定容至刻度，配成0.2mg/ml 的标准溶液；（2） 邻甲基苯胺试剂：称取硼酸 0.65g,溶于温热的 210ml 冰醋酸中，再加入1.25g 硫脲，充分溶解后加入邻甲基苯胺 37.5ml,用冰醋酸定

12、容至250ml，储存与棕色瓶内；（3） 2mol/l HCl 和 2mol/l NaOH。3. 发酵液四、 实验步骤1. 葡萄糖标准曲线的制作（1） 取干净试管 6 支，按下表加入各溶液；（2） 将各试管内溶液摇匀，套上试管帽，置于沸水浴中加热 10min；（3） 取出，用流水冷却至室温；（4） 用分光光度计在波长 635nm 下比色，读取吸光度，将结果填入表中；（5） 以吸光度为纵坐标，糖的毫克数为横坐标，绘制标准曲线。葡萄糖标准曲线的制作管号 1 2 3 4 5 6 葡萄糖/mg标准葡萄糖溶液/ml 蒸馏水/ml邻甲基苯胺试剂/ml002.040.05 0.251.754 0.10.51.

13、540.21.01.040.31.50.54 0.42.004A6352. 发酵液含糖量的测定（1） 酸解：如果发酵培养基内含有双糖或多糖，应先将它们水解成单糖，然后进行测定。测定时发酵液先用滤纸过滤。取发酵中的发酵滤液 2ml，置于干净试管中，加入 2mol/l HCl 2ml，摇匀，套上试管帽，置于沸水浴内水解 25min,使双糖或多糖水解为单糖；（2） 稀释：水解液用 2mol/l NaOH 调至中性，然后全量倒入 100ml 容量瓶中，用蒸馏水冲洗水解液，合并洗液，并定容至刻度，充分摇匀；（3） 显色：吸取稀释后的水解液 2ml，置于干净试管中，再加入邻甲基苯胺试剂，充分摇匀，套上试管

14、帽，置沸水浴加热 10min。取出后用流水冷却至室温；（4） 比色：以 2ml 蒸馏水代替水解液作对照管，在 635nm 波长下测定吸光度；（5） 计算:根据样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的葡萄糖毫克数，然后按下列公式算出每 100ml 发酵液中的含糖量。发酵液含糖量（g/100ml）=(AN)/(V1000)100式中：A 为由吸光度查标准曲线所得糖毫克数；N 为样品稀释倍数；V 为测定时所取的样品毫升数。五、 注意事项1. 葡萄糖必须经过干燥才能配成标准溶液，否则误差较大。2. 试管必须洗干净，不能留有残糖。实验五：淀粉酶产生菌的初筛一、实验目的学习淀粉酶产生菌的筛选方法。二、 实验

15、原理淀粉酶在酿造、纺织、食品加工、医药等领域具有广泛的用途。可以根据淀粉培养基上透明圈的大小来判断所选菌株的淀粉酶活力。本实验以淀粉酶产生菌的筛选为例，介绍发酵菌种的初步筛选。三、 实验器材与试剂1.菌株土壤、水、湖泊沉积物或其他富含微生物的样品2.培养基（1）淀粉酶产生菌筛选培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏 0.3%，NaCl 0.5%，可溶性淀粉 0.2%，琼脂 2%，pH7.27.4（2）高氏一号培养基：可溶性淀粉 20g，KNO 3 1g ,K2HPO4 0.5g ,MgSO47H2O 0.5g ,NaCl 0.5g,FeSO47H2O 0.01g,琼脂 20g，加水至 1000ml，pH

16、7.27.43.器材高压蒸汽灭菌锅，恒温干热灭菌箱，超净工作台，天平，电炉，1 mol/L HCL, 1 mol/LNaOH, pH 试纸、量筒，玻棒，三角瓶，玻璃珠，试管，培养皿，移液管等四、 实验步骤1. 培养基的制备通过称量、溶解、调节 pH 等步骤，配制上述培养基，并配制 45ml 无菌水（内装几颗玻璃珠）一瓶，4.5ml 无菌水若干支，0.1MPa 灭菌 30min 后备用；另包扎好培养皿、移液管和涂布棒等，灭菌，烘干备用。2. 倒平板将灭菌后的培养基冷却至 5060，以无菌操作法倒至经灭菌并烘干的培养皿中，每皿约 20ml。为了防止非目的菌株的生长，可在细菌和放线菌培养基中加入制霉

17、菌素使之达到 100mg/L，以抑制真菌生长。冷却凝固待用。3. 微生物分离（涂布法）（1） 称取样品 5g，放入装有 45ml 无菌水的三角瓶中，震荡 10min，即为 10-1 的土壤稀释液。（2） 取 4.5ml 无菌水 4 支，用记号笔编上 10-2、10 -3、10 -4、10 -5。（3） 去 10-1的稀释液，震荡后静止 2min,用无菌移液管吸取 0.5ml 上层细胞悬液加至装有 4.5ml 无菌水的试管中，制成 10-2 稀释液。同法依次稀释至 10-3、10 -4、10 -5 稀释液。在稀释过程中，因从高浓度到低浓度，每稀释依次应更换一支移液管。（4） 另取移液管，分别以无

18、菌操作法吸取 10-5，10 -4，10 -3 的稀释液 0.1 ml，加至制备好的平板上，用涂布棒涂布均匀。从低浓度到高浓度，可以用同一根移液管或涂布棒。（5） 将培养皿倒置培养于恒温培养箱中，30培养 57d 后观察。（6） 根据菌落形态特征，挑取有代表性的单菌落，在相应的培养基平板上划线，直至得到纯培养。纯化后的菌株应及时转接到斜面培养基上保存。4.分离纯化的菌株可点种与淀粉培养基平板上（每皿点种 5 点） ，形成菌落后，在平板上滴加卢哥碘液，以铺满平皿为度，如果菌落周围有透明圈出现，说明淀粉被水解，该菌能产生淀粉酶，透明圈与菌落直径之比越大，说明淀粉酶活力越强。五、思考题分离设计时应怎

19、样安排较为合理，是多皿一次分离为佳，还是少皿多次为佳？实验六：淀粉酶活力测定一、 实验目的1. 掌握分光光度法测定液化性淀粉酶活力的基本原理和方法。2. 从初筛所获的菌株中筛选出淀粉酶活力高的菌株。二、 实验原理淀粉酶（amylase）是指能催化分解淀粉分子中糖苷键的一类酶，包括淀粉酶，淀粉酶，糖化酶和异淀粉酶。淀粉酶可从淀粉分子内部切断淀粉的 1,4 糖苷键，形成麦芽糖、含有 6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，使淀粉的粘度下降，因此又称为液化性淀粉酶。淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在 660nm 处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。随着酶的不断作用，淀粉长链被切断，生成小分子糊精

20、，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定 淀粉酶活力。三、 实验器材与试剂1. 菌种实验五中筛选到的 淀粉酶产生菌。2. 培养基（w/v）豆饼粉 5%，玉米粉 7%，Na 2HPO4 0.8%,(NH4)2SO4 0.4%,NH4Cl 0.15%,用自来水配制。250ml 三角瓶中装培养基 25ml，8 层纱布封口，0.1MPa 灭菌 30min。3. 试剂（1） 碘原液：称取碘化钾 22g，加少量蒸馏水溶解，加入碘 11g，溶解后定容至 500ml，贮于棕色瓶中；（2） 比色用稀碘液：取原碘液 2ml，加碘化钾 20g,用蒸馏水定容至500ml，贮于棕色

21、瓶中；（3） 2%可溶性淀粉：称取可溶性淀粉（干燥至恒重）2g,用少量蒸馏水混合调匀，徐徐倾入煮沸的蒸馏水中，边加边搅拌，煮沸 2min 后冷却，加水定容至 100ml。需当天配制。（4） pH6.0 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠 4.523g，柠檬酸0.807g，用水溶解并定容至 100ml;（5） 标准糊精溶液：称取纯糊精 0.06g，悬浮于少量水中，调匀后倾入90ml 沸水中，冷却后加水定容至 100ml。加几滴甲苯防腐，冰箱保存；（6） 0.5mol/l 乙酸溶液，0.85%生理盐水。4. 器材恒温水浴锅、白瓷板、分光光度计等。四、 实验步骤1. 摇瓶培养挑取经活化后的斜面菌苔 3 环，悬于 5ml 无菌生理盐水中，吸取 0.5ml接入上述培养基中，30摇瓶培养（180r/min） 。每隔 8h 取出一瓶，将