10种细胞损伤模型建立方法.doc

1、10种细胞损伤模型建立方法 转载请注明来自丁香园 发布日期： 2012-10-09 14:36 文章来源： 丁香园 分享到： 收藏夹 新浪微博 腾讯微博 开心网 豆瓣社区 人人网 关键词： 细胞 细胞培养 技术专题 义翘神州 丁香园 丁香通 点击次数： 997 现在很多实验都涉及到细胞损伤模型的建立和运用，如 CCl4 诱导肝细胞损伤模型（体内、体外）、 PC12 细胞的 NO 和淀粉样蛋白 (A)损伤模型、神经元缺血再灌注损伤模型，以及脉络宁对骨骼肌缺血再灌注损伤保护作用等。 一、体外肝细胞损伤模型建立（ CCl4和 H2O2） 1 大鼠肝细胞的分离和培养 大鼠 4戊巴比妥麻醉，门 静脉插管

2、，先以无钙灌流液灌流，继以 37 通入 O2的 型胶原酶灌流液继续循环灌流 15 min。将肝脏移至一平皿内，轻轻撕去肝包膜后，加入含 5小牛血清的清洗液，用吸管吹打成单个肝细胞悬液， 200 目尼龙网过滤，低速离心（ 500 rmin-1，1 min， 4 ）弃上清，同法用清洗液反复洗 3 次。然后用完全 1640 培养液（内含 10小牛血清， 105 UL-1 青霉素， 100 mgL-1 链霉素和 10 mgL-1胰岛素）制成 1109 个 L -1 肝细胞悬液。分离的肝细胞经 0.6台盼蓝拒染法测得细胞活力大于 90，高碘酸雪夫反应显示糖原法鉴定 99为肝实质细胞。 将上述肝细胞悬液分

3、别加入 24 孔（每孔 1 ml）和 96 孔（每孔 0.1 ml）培养板中，置 37 ， 5 CO2 培养箱中培养。 12 16 h 后可见肝细胞贴壁于培养板孔底上生长。 2 CCl4 诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立 肝细胞培养 12 h 后，吸弃上清，更换培养液并加入不同浓度的 CCl4（ 1 16 mmolL-1），以少量的二甲亚砜助溶，二甲亚砜终浓度为 0.1（体积分数），作用不同时间（ 1 12 h）后，收集 24 孔板中培养上清检测 AST，以及肝细胞的 MDA 含量和 GSHpx活性；同步测定 96 孔板中培养肝细胞的 MTT 反应。根据检测结果制备 CCl4 诱导肝细胞损伤的量

4、效和时效曲线。选择最造损伤浓度和损伤时间制备肝细胞的损伤模型，同时设溶媒对照组，每组至少设 3 个复孔。 3 H2O2 诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立 同法更换培养液，加入不同浓度的 H2O2（ 0.2 3.2 mmolL-1），作用不同时间（ 0.5 4 h）后，收集24 孔板中培养上清检测 ALT，测定肝细胞的 MDA 含量；同步测定 96 孔板中培养肝细胞的 MTT 反应。根据检测结果制备 H2O2 诱导肝细胞损伤的量 效和时效曲线，选择最适损伤浓度和损伤时间制备肝细胞的损伤模型，同时设溶媒对照组，每组至少设 3 个复孔。 4 检测指标 （ 1） AST、 ALT 的测定 培养的肝细胞经

5、离心（ 1 800 rmin-1， 10 min）后收集上清，按试剂盒说明书步骤测定上清液中 AST 和 (或 )ALT 活性，结果以 U(106 cell)-1 表示。 （ 2） 肝细胞增殖试验 采用 MTT 比色法。 （ 3） 肝细胞谷胱甘肽过氧化物酶（ GSHpx）活性的测定 先制备 GSH 标准曲线。弃肝细胞培养上清，加入 0.2 Triton-100 水溶 液 0.5 ml，混匀，2 min 后，离心（ 2 500 rmin-1， 10 min），取上清液（肝细胞样品） 0.4 ml，另设样品空白管，非酶反应管和试剂空白管，加入各种试剂。混匀后立即计时，静置 12 min 后，以样品

6、空白管调零点，于 423 nm波长处读得吸光度（ A）值。在 GSH 标准曲线上查出对应的 GSH 波度。 GSHpx酶活力单位是在 37 ， pH6.5 条件下，每 106 个肝细胞、每分钟使 GSH 浓度下降 1 mol为 1 个酶活力单位。计算公式为： GSHpx活力单位 =（ GSH非酶管 - GSH样品管 - GSH 试剂空白管） /3。结果以 U(106 cell)-1 表示。 （ 4 ） 肝细胞丙二醛（ MDA）含量的测定 先制备 MDA 标准曲线。弃肝细胞培养上清，加入生理盐水 1 ml，混匀，移入离心管中，离心（ 2 500 rmin-1，10 min），弃上清，加 15 T

7、CA 2 ml，破坏细胞并沉淀蛋白质，加入 0.67 TBA 2 ml，于沸水浴中加热 30 min。根据样本的吸光度值在标准曲线上查出对应的浓度，结果以 nmol(106 cell)-1 表示。 （ 5） 数据处理 数据以 s 表示，计量资料组间比较采用 t 检验。两变量间相互关系，采用直线相关和回归分析。 二、体内肝损伤模型（酒精） 1、材料 纯系 SD 雄性大鼠，体重 180g 200 g，由浙江大学医学院实验动物中心提供。食用酒精选用北京酿酒总厂出品的 56 度红星二锅头。 2、方法 将大鼠随机分成 5 组，饲养在 23 25 室内，自由进食、进水；根据大鼠体重， A、 B、 C、 D

8、组每日用 56红星二锅头白酒以 10ml/1Kg 分别灌胃 0、 4 周、 8 周和 12 周； E 组于酒精灌胃 12 周后，停止灌胃 4 周。大鼠通过股动脉采血处死，收集血浆和肝脏标本。 3、主要指标检测 （ 1）肝功能：应用日立 7170 自动生化分析仪测定总蛋白（ TP）、白蛋白（ Alb）、球蛋白（ Glb）、丙氨酸氨基转移酶（ ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（ AST）等。 （ 2）氧化抗氧化物质测定：采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒分别检测丙二醛（ MDA）、谷胱甘肽过氧化酶 (GSH-Px)、谷胱甘肽（ GSH）、超氧化物歧化酶 (SOD)和谷胱甘肽 -S-转移酶（ GST

9、）。 （ 3）大鼠肝脏病理检查：大鼠处死后立即取出肝脏，称重后一部分以 10%的福尔马林液固定作病理，作常规石蜡切块并 HE 染色，在光学显微镜下进行观察，用 半定量法分别判定脂肪变性、及酒精性肝炎炎症活动度 三、四氯化碳体外损伤肝细胞模型 原代培养的正常大鼠肝细胞培养 24h（贴壁良好）后，置培养皿于一密闭的塑料盒，内置四氯化碳 0.4M容积， 37 度 90min，造成肝细胞损伤的模型，后转入正常培养，进行下一步实验。 (即熏蒸法 ) 肝细胞培养 12h 后，吸弃上清，更换培养液并加入 CCL4 8mM（事先用 DMSO 溶解， DMSO 终浓度 1），作用 6h 后收集 24 孔板中培养

10、上清检测 AST以及肝细胞 MDA 含量盒 GSHpx活性，评价损伤程度。（常用方法） 四、醋氨酚体外损伤肝 细胞模型 肝细胞培养 24h 后，用清洗液洗 2 次，培养液洗 1 次，然后换以 20mM醋氨酚的培养液，继续培养 12h，取培养液，进行下一步实验。 五、过氧化氢体外损伤肝细胞模型 肝细胞培养 24h 后，吸弃上清液，更换培养液并加入 H2O2 0.6mM，作用 1h 后，收集 24 孔板中的培养上清液检测 AST 活性和 MDA 含量。 六、氰化钾缺氧肝细胞损伤模型 肝细胞培养 24h 后，贴壁生长良好的肝细胞中加入氰化钾 2.5mM，继续培养 2h，定量检测培养液上清中 LDH

11、活性，以及酶的活性反应肝细胞损伤程度。本模型可以更好的模拟缺氧 损伤。 七、硫代乙酰胺（ TTA）体外肝细胞损伤模型 肝细胞预培养 24h 后，贴壁生长良好的肝细胞中加入 TTA0.18mM，继续培养 48h，肝细胞大量损伤和坏死，上清液中乳酸脱氢酶（ LDH）活性升高，造成体外损伤肝细胞模型。 八、内毒素体外损伤肝细胞模型 贴壁生长良好的肝细胞中加入内毒素 70uL/mL，置 37 度， 5 CO2 培养此时上清 LDH 活性升高造成肝细胞损伤模型，造成体外肝细胞损伤模型。 九、半乳糖胺（ GalN）体外损伤模型 分离肝细胞，预培养 12-24h 后，待细胞贴壁生长均匀后，加入 5mMGal

12、N的肝细胞培养液，继续培养 1.5h，测定培养上清液中 ALT， ALT 显著升高时，肝细胞造模成功。 十、帕金森体外模型 体外培养的中脑多巴胺能神经元 MPTP 损伤模型 l 实验操作：实验采用胚胎龄 14 一 16 天的大鼠，剖子宫取胎，取胎鼠中脑腹侧区。可将多个胚胎来源的组织收集在一起，置 Fl2 培养基（ Gibco）至 35mm的培养皿中，以细剪刀剪碎。将 2ml 含 0.125的胰酶的 F12 加入到组织中，该混合物于 37 孵育 10 分钟后，加入 DNase I（ Sigma）至终浓度 80ng m1，继续于 37oC 孵育 10 分钟。消 化后的组织以尖端被火抛光的移液管轻轻

13、吹打 8 次。该细胞悬液以种植培养基稀释（种植培养基： MEM，补充以2mm谷氨酰胺， 6mg/ml 葡萄糖， 1mg ml 谷胱甘肽， 10 units ml 青霉素， 10ul/ml 链霉素和 7.5胎牛血清）。细胞然后种植于 35mm 的预先以10ug m1 po1y1ysine （ Sigma）和 2.5ug ml merosin（ Chemicon）铺底的培养皿中，种植密度为 50,000 细胞 cm2。培养 16 小时后，培养基换为无血清培养基。该培养基为 F12 和 basa1Eag1es medium，补充以 33mM葡萄糖， 2mM谷氨酰胺， 15 mM碳酸氢钠， 10mM

14、HEPES（ pH7.0），1ug ml 谷胱甘肽， 20ug/ml 胰岛素， 100ug/ml 转铁蛋白， 60uM腐胺， 20nM孕酮， 20nM亚硒酸钠（ NaSe）， 30nM三碘甲状腺原氨酸， 0.5 unit/ml青霉素和 0.5mg/ml 链霉素。 毒物处理：于第 4 天以 1uMMP+处理 48 小时。然后进行分析。 模型评价：倒置显微镜下观察细胞形态、细胞计数、免疫组化检测 TH 阳性细胞的数目和形态。 体外培养的中脑多巴胺能神经元 6-OHDA 损 伤模型 采用上述方法选择胎鼠，分离中脑腹侧部，解剖显微镜下仔细剔除脑膜和血管，用高糖 T-BSS反复冲洗涤之七遍。并将组织剪碎

15、，移入 0.25胰蛋白酶溶液中， 37oC 振荡消化 30 分钟，后加入血清数滴终止消化，用吸管轻轻吹打后，加入不含血清的 DMEM培养液混匀， 1000rpm， 10min 离心收集细胞，反复 2 次，后加入含血清的完全 DMEM培养液悬浮细胞，过 220 目不锈钢筛网使成单细胞悬液，计数后将约 3106 个细胞接种人事先涂有多聚赖氨酸的35mm的六孔培养板中，置 37oC、 5 CO2 培养箱中培养。 24 小时后待 细胞完全贴壁时，置换旧培养液，以后每隔 2 天更换一次培养液。培养至第六天时加入 100uM的 6-OHDA 处理 3 小时后吸出。在相应备孔中加入完全 DMEM培养液洗涤 2 遍，再加入完全 DMEM培养液继续置 5 CO2 培养箱中培养24 小时，采用与上述相同的方法做免疫细胞化学染色，计数 TH 阳性细胞，确立 6-OHDA 对体外培养的多已胺能神经元的损伤作用。