微波辅助骨碎补黄酮的提取及抗氧化活性研究.DOC

1、 微波辅助 骨碎补黄酮的 提取及抗氧化活性研究 祁小妮 1，王俊龙 1，李振亮 1， 党金宁 1， 张志琪 2 (1.化学与生命科学系，甘肃民族师范学院，甘南，甘肃 747000) （ 2.药用资源与天然药物化学教育部重点 实验 室、化学化工学院，陕西师范大学，西安，陕西 710062） 摘 要 ： 采用 微波辅助结合响应曲面优化 (RSM)法，对骨碎补黄酮提取中的 原料质量浓度 ，微波功率及微波时间等 工艺参数 进行了优化 ， 确定 了 骨碎补黄酮 提取率 与提取因素之间 的 定量 关系 及因素之间的 最佳水平组合。 考察 了 骨碎补黄酮清除羟基自由基 （ OH）和 过氧 负离子 自由基 （

2、 O22-）的能力。结果表明， 骨碎补黄酮 的 最佳提取条件为 ： 原料 质量浓度 0.03g/L，微波功率 400 W、微波时间 10 min，在此条件下，骨碎补 黄酮 的 提取率 最高 ， 达 5.45%； 抗氧化活性 实验 结果 表明， 当 提取的 骨碎补黄酮的 质量 浓度分别为 2.5 g/L 和 3.5 g/L 时， 骨碎补黄酮对 OH 及 O22-的 清除率分别为 10.12%和 35.71%。以上结果表明，通过响应曲面确定了 提取率 与影响因素之间的二次多项函数模型，为 骨碎补黄酮的 定量提取提供了理论依据 ； 同时 也 说明 骨碎补黄酮具有 一定的 体外抗氧化活性 。 关键词

3、： 骨碎补；黄酮；微波辅助； BBD 设计；抗氧化活性 Optimization of process for microwave-assisted extraction of flavonoids from drynaria rhizome and its antioxidant activity QI Xiao-ni1 , WANG Jun-long1, LI Zhen-liang1, DANG Jin-ning1 , ZHANG Zhi-qi2 (1.The Department of Chemistry and Life Sciences, Gansu Normal Universit

4、y for Nationalities, Gannan 747000, China) (2.Key Laboratory of Medicinal Resources and Natural Pharmaceutical Chemistry and School of Chemistry and Chemical Engineering, Shaanxi Normal university, Xian 710062, China ) Abstract: In this work, an extraction procedure parameters of drynaria rhizome fl

5、avonoids (DRF) by Box-Benhnken central combination design coupling microwave-assisted with alcohol as solvent was established. The quantitative criterion between yield of drynaria rhizome flavonoids and extracting factors and optimum level combination were determined by the response surface methodol

6、ogy. The antioxidant activty was estimated by the scavenging activitiy against hydroxid1radical and peroxyl radical with the oxidation of salicylic acid and self-oxidation of pyrogallic acid system. The results showed that the best extraction of flavonoids was mass concentration, microwave power and

7、 microwave time（ 0.03 g/L、 400 W、 10 min） and achieved the maximum yield of 5.57%. The evaluation of antioxidant activity suggested that the flavonoids exhibited significant antioxidant activity and obtain maximum scavenging activity of 10.12%(2.5 g/L) and 35.71%(3.5 g/L) for 基金项目：国家自然科学基金（ 21275098

8、），甘肃省高等学校科研项目资助（ 2016A-093） 作者简介：张志琪（ 1958-），男，陕西榆林人，教授，博士，主要从事药物分析及中草药有效成分研究 。Email:zqzhangsnnu.edu 通讯 作者： 祁小妮 （ 1987-）， 女 ， 陕西咸阳人 ， 讲师 ， 硕士 ，主要从事天然产物活性成分分析与研究。 Email: hydroxide radical and peroxyl radical respectively. The above experimental results show that extraction yield was determined by th

9、e response surface and quadratic multinomial function model between influence factors, which provides a theoretical basis for the extraction of quantitative. The drynaria rhizome flavonoids has antioxidant activity in vitro, which can be used in food and pharmaceutical and chemical industry for a na

10、tural preservative oxidation reagents. Key words: Drynaria rhizome； Flavonoids； microwave-assisted； BBD design； Antioxidant activty Foundation items: Natural Science Foundation of China ( Grant No 21275098 ) ; Gansu Institution of Higher Education Research Projects Foundation of China ( Grant No 201

11、6A-093) 骨碎补 (Drynaria rhizome)为水龙骨科植物槲蕨 Drynaria fortunei(Kunze) J.Sm及中华槲蕨 Drynaria baronii(Christ) Diels的干燥根茎， 其主要以根茎入药 。 因其 根茎的形状与姜块类似，且在其块茎表面分布如鳞片状细小的褐棕色绒毛，所以也有猕猴之姜的美称 1。由于在临床上经常用于跌打损伤病症的治疗，因此得名骨碎补。骨碎补的主 要化学成分以二氢黄酮和糖苷类化合物为主 2。 在中西医临床上对症治疗肾亏阴虚 、耳鸣耳聋、牙齿掉落、跌打损伤及骨裂骨折等病症 3。 然而有关于骨碎补黄酮的有效提取及相应产品的综合开发利用

12、还处在起步阶段 。 根据已有的文献报道 ，提取黄酮类化合物的研究方法较多，如 刘晓娇 4等人研究了 商洛产粗榧叶总黄酮提取工艺和抗氧化活性 ，结果表明，采用正交 实验 研究黄酮 提取率 与提取因素之间的非线性关系，虽然得出了最佳的黄酮提取因素组合，但是仍存在研究不彻底， 不全面等 缺点 ，对两两因素之间的交互作用不能通过正交 实验 给出明确 的 结果； 李彩 霞 5等 、 王明艳 6等人分别研究了 “黑美人”土豆 黄酮 和毛冬青根 黄酮 的 提取 工艺，结果表明，尽管二者都采用了响应曲面对因素与 提取率 之间的二次函数模型进行优化，得到了最佳的因素水平组合 ， 但是， 提取率 仍然较低 ，分别

13、为 1.03%、 0.419%。 由于 微波辐射能够加速有效物质的快速溶出，可以间接提高黄酮的提取效率 ， 因此，采用微波辅助提取黄酮 类 化合物，有望提高黄酮的提取效率。 李志平 7等人 采用 微波辅助 法 提取柿叶黄酮 ， 提取率 最高达 25.1%； 马燕燕 等 8人以及 赵文红 9等人分别采用 响应面优化酶法提取柿叶黄酮 和热水法 提取柿叶黄酮的最高 提取率 分别为 2.47%和 6.12%；另外， 卢润双 10等人采用 微波 辅助法 提取山楂黄酮 的 提取率 最高为 8.02%。霍红 11等人采用乙醇提取柿叶黄酮的 提取率 为 4.308%。 以上研究结果表明，采用微波辅助提取黄酮，

14、比水提和醇提等其他方法 的提取 效率高。 因此， 为了提高黄酮的 提取率 ，同时还要能够全面分析提取因素之间的交互作用， 避免正交 实验 出现的析因不全等问题， 本文采用微波辅助 结合响应曲面优化法 ，对骨碎补黄酮提取中的 原料质量浓度 ，微波功率及微波时间进行 了 优化，以期能够得出最佳的 因素水平 组合，获得较 高的提取效率。 同时研究了骨碎补黄酮在人工模拟的体外环境下对自由基的清除能力 ， 以此说明其抗氧化活性 ， 为骨碎补黄酮功能产品的研发提供实验依据 。 1 材料与方法 1.1 材料 、试剂 与 仪器 骨 碎 补：购自于 甘南中药材大药房 ， 乙醇 、 亚硝酸钠 、正丁醇、 乙醚 、

15、 硝酸铝 、 氢氧化钠 、丙酮、维生素 C、 硫酸亚铁 、 水杨酸 、 过氧化氢 （ 质量分数 30%） 、 邻苯三酚， Tris-盐酸 ， 浓盐酸， 以上均为 试剂 纯 ，购于兰州龙腾盛世化学试剂有限公司 ； 芦丁 ： 生化试剂 ，购于 国药集团化学试剂有限公司 。 SHB-循环水真空泵（ 江苏荣达仪器设备有限 公司 ）； GZX-DH-600 电热恒温干燥箱（ 浙江海安医疗器械厂） ； PHS-3C 精密 pH计（上海雷磁仪器厂）； FA2004 电子天平（上海精密科学仪器公司）JEHS-南京普惠 恒温水浴锅（ 南京 精密仪器 有限 公司）； UV1600-双光束紫外可见分光光度计 （上海

16、美普达仪器 有限公司 ） 。 1.2 实验 方法 1.2.1 骨碎补黄酮提取 工艺 的单因素 实验 设计 在微波功率和微波时间确定的基础上 ，研究不同 的原料质量浓度 （ 0.01、 0.02、 0.03、 0.04、 0.05 g/L）对黄酮提取率的影响；在微波功率和 原料质量浓度 确定的 基础上，研究微波时间（ 4、 6、 8、 10、 12 min）对提取率的影响；在微波时间和 原料质量浓度 确定的基础上，研究微波功率（ 160、 320 、 400 、 480、640 W）对提取率的影响。 1.2.2骨碎补黄酮的提取工艺流程 取粉碎的 骨碎补 5 g， 加入不同 体积的 乙醇作为 提取

17、 溶剂，使骨碎补具有不同的质量浓度 ，摇匀 浸泡 24 48 h，根据不同的微波功率将 实验 分成三组，在同一微波功率条件 下 ，控制不同的微波时间与 原料质量浓度 ，萃取完成后，利用循环水浴真空泵快速抽滤，将过多的乙醇提取溶剂通过旋转蒸发回收 ，加入蒸馏水搅拌 30 min左右，离心或者静置，取上层清液，定容至一定体积，留存备用 12。 1.2.3 骨碎补黄酮含量分析 采用 比色法 13进行黄酮含量的测定， 具体的操作步骤参照文献 14-15：准确量取 1 mL样品液于 50 mL容量瓶中，加入体积分数为 60%的乙醇至 6 mL，加入 质量分数为 5% NaNO2溶液 1 mL，摇匀，静置

18、 6 min，加入 质量分数为 10%的 Al(NO3)3溶液 1 mL，摇匀，静置 6 min，加入 质量分数为 4%的 NaOH溶液 10 mL，最后用 体积分数为 60%乙醇溶液定容，并摇匀， 静置 15 min。以不含黄酮的试剂空白作为对照，在 510 nm下测定 芦丁标准品及 样品 的 吸光度值， 以吸光度值作为纵坐标，以 芦丁 浓度作为横坐标绘制标准曲线，然后 根据芦丁 标准曲线求得黄酮 的 提取率 。 黄酮提取率计算公式如下。 黄酮 提取率 %=( VD)/W100 式中： 为 提取液中骨碎补黄酮的质量浓度 ， g/L； V为 提取液 的体积， mL； D为稀释的倍数； W为 原

19、料干重 ， g。 1.2.4 骨碎补黄酮响应曲面 实验 设计 以单因素 实验 为基础，选择最优的单因素作为响应曲面优化的基础影响因素，根据 Box-Behnken设计 16结合中心 实验 组合原理 17， 确定骨碎补黄酮 提取率 与影响因素 之间的水平 组合 ， 实验 设计结果如表 1所示。 表 1 实验 因素及水平 Table 1 factors and levels of test 1.2.5 骨碎补黄酮抗氧化活性分析 1.2.5.1羟基自由基 （ OH） 清除 能力测定 参考 Fenton反应体系模型 18-20，在 9 mmol/L的 水杨酸 -乙醇溶液 中 (乙醇作为溶剂 )， 加入

20、 9 mmol/L FeSO4， 再 加入 8.8 mmol/L H2O2， 生成具有 强氧化活性的反应体系。然后分别加入 芦丁 标准溶液和不同浓度的骨碎补黄酮溶液 ， 与水杨酸竞争羟基自由基， 从而使反应体系的吸光度值减小 。采用固定反应时间法，在相同体积的反应体系中加入不同质量浓度的骨碎补黄酮溶液，用蒸馏水作为试剂空白，在波长 510 nm 处测吸光度值，以羟基自由基清除率为衡量抗氧化活性指标 21-22 ，以同浓度的维生素C 作为阳性对照，骨碎补黄酮对羟基自由基 的 清除率 按下 式 计算 ： 清除率 /%=1 (A1 A2)/A3 100 式中： A1 为加入 骨碎补 黄酮溶液后 溶液

21、 的吸光度值； A2 为 以蒸馏水代替显色剂 的吸光度值； A3 为 以蒸馏水代替 骨碎补 黄酮的 空白 组 的 吸光度值。 1.2.5.2 过氧负离子自由基（ O22-） 清除能力的测定 根据 黄酮 清除过氧 负离子 自由基的原理，结合已有的文献报道 23-24，采用邻苯三酚（焦性没食子酸 ）在自身氧化的过程中产生的过氧负离子自由基作为反应体系的目标靶物质，以 不加显色剂 的对照 组 吸光度值与溶液 本身 吸光度值之比，作为评价清除率的指标。具体的 实验 操作为：取 8支具塞的 10 mL比色管 ，贴上标签，首先加入 4.5 mL、 0.1 moL/L Tris-HCl缓冲液（ pH=8.2

22、） ，再分别加入 0.5、 1.0、 1.5、 2.0、因素 factors 水平 levels -1 0 1 A 原料 质量 浓度（ g/L） 0.01 0.03 0.05 B 微波功率（ W） 320 480 640 C 微波时间（ min） 8 10 12 2.5、 3.0 g/L 不同浓度的 黄酮 溶液 各 1 mL，混匀， 25 静置 10 min， 加入反应试剂 焦性没食子酸 （ 6 mmoL/L） 0.1 mL、 继续加入浓盐酸（ 12 moL/L） 0.1 mL， 终止反应。 在特征吸收波长 （ 330 nm） 处 测定 不同浓度 溶液的吸光度值 。以不加焦性没食子酸 的实验组

23、 作为空白，以不加 黄酮 的反应组作为对照。骨碎补 黄酮对 O22-自由基 的 清除率 按下 式 计算： 清除率 /%=(A0 Ai)/(A0 A)100 式中 ： A0为 对照组的吸光度值； A为 空白组的吸光度值； Ai为 加入 黄酮 的 实验 组吸光度值 ； 2 结果与分析 2.1芦丁标准曲线 图 1 芦丁标准曲线 Fig. 1 Standard curve of Rutin 黄酮类化合物的测定以芦丁为标样， 根据芦丁标准品 与吸光度值 绘制标准曲线 ，计算骨碎补黄酮的含量， 通过 线性回归方程可知， 芦丁 标准品 的线性范围 为 0.01 0.05 g/mL。而且， 吸光度值与标准浓度

24、之间具有较好的线性关系 （ R2=0.9794）。 2.2 单因素 实验 结果分 析 2.2.1 液料比对骨碎补黄酮提取率的影响 按照 1.2.1 节方法进行实验， 考察不同 原料质量浓度 对骨碎补黄酮提取率的影响，结果如 图 2 所示 。 芦丁 质量 浓度 （ g/mL） 吸光度值0 .01 0 .02 0 .03 0 .04 0 .050 .00 .10 .20 .30 .40 .50 .60 .7y =14 .74 x -0 .06 9 2R2= 0. 9743图 2 原料质量浓度对黄酮提取提取率的影响 Fig. 2 Effects of mass concentration flavo

25、noids extraction 从图 2 可以看出，当 原料质量浓度 从 0.01 g/L 增加至 0.03 g/L 时，总黄酮的 提取率 增加趋势非常明显，在 原料质量浓度 为 0.03 g/L 时达到最大值 为 5.42%， 继续增加原料的质量浓度 ，黄酮的 提取率 不仅没有增加反而减小， 原因可能是在其他操作条件一定时，适当增大 原料质量浓度 有利于黄酮溶出，但是继续加大 质量浓度 ，微波内加热作用和超声波空化作用反而降低，即细胞膜和细胞壁破碎效果减弱，黄酮溶出减少，黄酮 收 率下降 ， 这与 山豆根黄酮的提取及抗氧化抑菌活性 研究结果一致 25，所以确定最佳 的原料质量浓度为 0.0

26、3 g/L。 2.2.2 微波功率对骨碎补黄酮提取 率 的影响 按照 1.2.1 节方法进行实验，考察不同微波功率对骨碎补黄酮提取率的影响，结果如图 3 所示。 图 3 微波功率对骨碎补黄酮 提取率 的影响 Fig. 3 Effects of microwave power on flavonoids extraction 由图 3 可知，骨碎补黄酮的 提取率 与微波功率之间存在明显的 量效关系 ，当微波功率增加到 400 W时， 黄酮的提取率最大 为 4.82%， 随着微波功率的逐渐增大， 黄酮 提取率 没有增加 ， 反而减小。 原因原料质量浓度（ g/L） 0. 01 0. 02 0. 0

27、3 0. 04 0. 052. 02. 53. 03. 54. 04. 55. 05. 5提取率（%）提取率（%）微波功率（ W） 160 240 320 400 480 560 640 7202. 53. 03. 54. 04. 55. 0可能是随着微波功率的增大，微波的内加热效应显著增强，细胞壁和细胞膜破碎效果增大，黄酮类化合物迅速离开细胞并溶解到水中，当微波功率过高时，过大的微波辐射能量可能会破坏化合物结构 26，导致黄酮得率下降，故微波功率以 400 W 为宜 。 2.2.3 提取时间对骨碎补黄酮提取 率 的影响 按照 1.2.1 节方法进行实验，考察不同微波时间对骨碎补黄酮提取率的影

28、响，结果如图 4 所示。 图 4 微波时 间对黄酮提取 提取率 的影响 Fig. 4 Effects of microwave time on flavonoids extraction 由图 4 可知：在 4 10 min 内，黄酮的 提取率 与时间呈正相关性，浸提时间在 10 min 时，黄酮 提取率 达到最大值 为 5.27%，之后随着微波辐射时间的延长， 提取率 开始减小 。 原因可能是随着提取时间的延长，微波辐射能量越来越大，有利于细胞膜和细胞壁 的 破碎，黄酮溶出量增强，但是当提取时间过长时，过大微波辐射能量可能会引发部分黄 酮化合物分解， 黄酮 物质可能被微波巨大的机械能所破坏

29、25， 导致黄酮得率降低，故提取时间以 10 min 为宜。 2.3 骨碎补中黄酮 提取率 响应曲面设计结果分析 骨碎补黄酮 提取率 与三因素之间的相互作用结果如表 2 所示。 提取率（%）微波时间（ min） 4 6 8 10 122. 02. 53. 03. 54. 04. 55. 05. 5表 2 Box-Behnken 设计及黄酮 提取率 响应值 Table 2 Box-Behnken design and the response values for yields of flavonoids. 利用响应曲面分析软件，对 提取率 与提取因素之间的作用方式给出 了 模拟函数方程 ：Y=

30、5.39+0.15A+0.21B+0.13C+0.033AB-0.048AC+0.10BC-0.29A2-0.75B2-0.33C2 ，并对所得的数据进行显著性分析，确定 了 因素对 提取率 影响的 显著 程度， 实验 结果如表 3所示。 表 3 响应曲面 实验 结果方差分析 Table 3 The response surface experiment results anova analysis 方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性 标识 模型 3.69 9 0.41 4.24 0.0349 * A 0.18 1 0.17 1.88 0.0131 * B 0.34 1 0

31、.34 3.57 0.0019 * C 0.13 1 0.13 1.35 0.2839 AB 4.33610-3 1 4.33610-3 0.045 0.0083 * AC 9.02510-3 1 9.02510-3 0.093 0.7688 BC 0.041 1 0.041 0.42 0.0356 * A2 0.35 1 0.35 3.60 0.0798 实验 号 A 原料质量浓度(g/L) B 微波功 率（ W） C 微波时间（ min） 黄酮 提取率 （ %） 1 -1 0 1 4.48 2 0 0 0 5.40 3 1 0 1 4.85 4 0 0 0 5.53 5 0 -1 -1 5

32、.10 6 0 1 -1 4.32 7 1 -1 0 4.31 8 1 0 -1 5.03 9 -1 -1 0 4.28 10 0 0 0 5.57 11 0 1 1 5.02 12 0 -1 1 4.45 13 0 0 0 5.50 14 -1 1 0 4.30 15 1 1 0 4.53 16 -1 0 -1 4.47 17 0 0 0 5.53 B2 2.15 1 2.15 22.20 0.0022 * C2 0.45 1 0.45 4.67 0.0376 * 残差 0.68 7 0.097 失拟项 0.42 3 0.14 2.22 0.2284 纯误差 0.25 4 0.063 总和

33、4.37 16 注： *代表 P0.05） 同时也 说明 实验 过程中，黄酮 实验 数据测定 值之间具有较小的偏差。 通过各因素之间的交互作用可知 ， 微波功率 （ B） ， 原料质量浓度 与 微波功率（ AB）以及微波功 率与微波功率 （ B2） 两两因素的交互作用对骨碎补黄酮的 提取率具有极显著的影响 （ P0.01），然而，其他的多因素之间的交互作用属于显著（ P0.05） 影响， 根据回归分析结果（表 3）利用 Design-Expert软件对 两两因素之间的交互作用给出 3D曲面图，结果如图 5所示 ,。 W B 微波时间 （ min） 原料质量浓度 （ g/L） 黄酮提取率% 原料

34、质量浓度 （ g/L） 微波功率（ W） 黄酮提取率% A 图 5 各交互作用因素对黄酮 提取率 的响应曲面图（ A-C） Fig .5 Response surface plots (A C) showing the effects of the variables on the yield of flavonoids. 从图 5可知， 提取率 与影响因素之间具有较高的显著性，表现为在三维空间抛物面的曲度较大， 而且开口朝下 ，说明该函数模型具有极大值，根据所建立的函数模型，优化得出骨碎补黄酮的最佳提取条件为 ： 原料质量浓度 0.031 g/L、微波时间 9.7 min、微波功率 401.

35、7 W。 根据实际情况，结合具体操作，将优化的提取因素调整为微波时间 10 min、微波功率 400 W、 原料质量浓度 0.03g/L，在调整后的提取条件下，平行做 5次 实验 ，黄酮的平均 提取率 最高 为 5.57%。 实验 结果表明，采用响应曲面优化能够较为合理的选择提取因素，科学客观的评价提取因素与 提取率 之间的相关性 27。 2.4 骨碎补黄酮抗氧化活性结果分析 按照 1.2.5节的方法进行实验，考察骨碎补黄酮 对 羟基自由基 和过氧负离子自由基的 抗氧化活性 ，实验结果如图 6和图 7所示。 图 6 骨碎补黄酮对 羟基 自由基的清除率 Fig. 6 Clearance rate of drynaria rhizome flavonoids for hydroxide radical C 微波功率 （ W） 微波时间 （ min） 黄酮提取率% 质量浓度（ g/L） 0. 5 1. 0 1. 5 2. 0 2. 5 3. 0 3. 501020304050607080骨碎补V c清除率%