奶牛乳腺上皮细胞三维培养的形态学观察100305.doc

1、奶牛乳腺上皮细胞三维培养的形态观察 王秀美 1 考桂兰 1 高爱武 2* 侯先志 1 高民 3 （ 1. 内蒙古农业大学动物科学与医学学院，呼和浩特 010018； 2.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，呼和浩特 010018；3. 内蒙古农牧业科学院， 呼和浩特 010010） 摘要：本研究利用原代培养后纯化的奶牛乳腺上皮细胞，以 Matrigel 为基质胶原，进行奶牛乳腺上皮细胞的三维培养，细胞接种浓度分别为 1 104 细胞 /ml、 1 105 细胞 /ml 和 1 106 细胞 /ml。经过 16 天培养后，用 DAPI 对细胞染色， 利用荧光显微镜观察细胞生长状况。结果表明，当细胞

2、接种浓度为 1 104 105 细胞 /ml 时，细胞形成了团块状结构，出现了类似腔状的腺泡形态。 关键词：奶牛乳腺上皮细胞；三维培养；基质 1 引言 乳腺组织的上皮细胞能以血液中各种营养物质为原料，合成并分泌乳汁。建立可表达泌乳蛋白的乳腺上皮细胞系，能够极大方便乳腺上皮细胞中乳成分基因表达及调控的研究，为进一步研究各种营养因素对泌乳过程的影响奠定基础。 乳腺上皮细胞在体内存在于三维环境中，细胞外广泛分布着胞外基质（ extracellular matrix， ECM）， 它们主要由细胞分泌的蛋白和多糖构成。胞外基质对细胞形态、生长、凋亡和代谢功能起重要的调控作用，如 -酪蛋白的基因转录就受到

3、激素及细胞与基质相互作用的共同协调 1。乳腺上皮细胞在体内基质环境中，形成中空腔状的腺泡结构。 常规的体外细胞培养都是单层培养（二维培养），形成贴壁生长的单层细胞形态。研究证明，二维生长的人乳腺上皮细胞不能形成腺泡结构，缺失了对生长因子和催乳激素的响应，并且也检测不到分化所产生的蛋白质，如乳清蛋白和 -酪蛋白。但当它们生长于胞外基质成分中时，就能形成腺泡结构，并对激素信号产生响应 2。类似的关于胞外基质信号对上皮细胞生理和生化的影响在其它组织的研究中也得到了证实 3,4,5。此外，单层培养的牛乳腺上皮细胞也不能长时间维持乳蛋白的合成与分泌 6,7,8。上述结果说明，常规的二维细胞培养不能模拟体

4、内乳腺上皮细胞的腺体结构，因此不能提供理想的体外模型以研究细胞的代谢功能9。模拟细胞体内生存状态的三维细胞培养技术成为今后细胞培养技术发展的必然趋势。 本试验以奶牛乳腺上皮细胞为研究对象，对传代培养的奶牛乳腺上皮细胞进行三维培养，并比较二维和三维培养的奶牛乳腺上皮细胞的形态学差异，旨在为后 续的乳腺上皮细胞三维培养提供合理依据。 2 材料与方法 2.1 试验材料 2.1.1 乳腺组织 选取健康的 5-7 岁泌乳中国黑白花奶牛的乳腺组织。 2.1.2 试剂及仪器 培养基分别为 DMEM/F12（高糖型， Gibco 公司）和乳腺上皮专用培养基（ Sciencell 公司）；根据试验需要，向其中添

5、加胰岛素转铁蛋白（ ITS, ），表皮生长因子（ EGF）、氢化可的松（ Hydrocortisone）、标准胎牛血清（ FBS， highcolone 公司）和 Matrigel（ Gibco 公司），组成及浓度如表 1 所示。 型 胶原酶、胰蛋白酶（ Trypsin）、 EDTA 为 Chembasebio 公司生产。使用时，将型胶原酶用基础培养基溶解，制成终浓度为 0.5%的溶液，备用。用于消化细胞的胰蛋白酶溶液和 EDTA 溶液浓度分别为 0.25%和 0.02%。 细胞培养用其余试剂购自国产公司。除 Matrigel 外，所有试剂均采用过滤方式除菌，滤膜孔径为 0.22 m。 细胞染

6、色用 DAPI 为 Sigma 公司产品，染液按照说明书进行配制，备用。 试验所用其它仪器有荧光倒置相差显微镜（ Motic 公司）、 CO2 培养箱（香港力康）、超净工作（江苏苏净）及 离心机等。 2.2 试验方法 2.2.1 乳腺组织的取样 于呼和浩特市北亚清真屠宰场选择健康的 5-7 岁泌乳奶牛，屠宰后立即选取乳腺组织， 表 1 用于细胞培养的培养基配方 Table 1 The medium composition for cell culture 培养基组成 生长培养基 终止培养基 分析培养基 DMEM/F12 基础培养基 860ml 900ml 上皮细胞专用培养基 98ml 胎牛血清

7、（ FBS） 100ml 100ml (终浓度： 10%l) (终浓度 ： 10%l) 生长激素（ EGF） 10ml (贮液浓度： 1 g/ml） (终浓度： 10ng/ml) 胰岛素转铁蛋白（ ITS） 10ml (贮液浓度： 500 g/ml) (Insulin 终浓度： 5g/ml) 氢化可的松（ He） 10ml (贮液浓度： 1mg/ml) (终浓度： 10 g/ml) 双抗（ Pen/Strep） 10ml (贮液浓度： 10000unit/ml) (终浓度： 100unit/ml) Matrigel 2ml (终浓度： 2%) 经过 75%酒精处理后，用灭菌的手术刀、手术剪和镊

8、子于乳腺组织中上部取样。取样时，剪取约 50g 腺泡丰富、较少导管和脂肪的乳腺组织，立即投入含 3双抗的灭菌 PBS 缓冲液中，晃动容器冲洗乳腺组织，然后倒掉缓冲液，加入新的缓冲液，再次对所取乳腺组织进行清洗。重复此操作 3 5 次，直至 PBS 缓冲液变清亮，说明样品已清洗干净。然后用无菌手术镊子将样品移入一新的含 3双抗的灭菌 PBS 缓冲液中，置于冰盒内迅速带回实验室，进行后续实验操作。 2.2.2 奶牛乳腺上皮细胞的原代培养 将带回的乳腺组织用 75%酒精浸泡约 30s，除去表面细菌，然后用含 1双抗的灭菌 PBS缓冲液清洗 3 次，用灭菌手术剪去除酒精浸泡的表面部分，取内部新鲜组织样

9、品，剔除脂肪和结缔组织，然后剪碎为直径 1-2mm 的微粒。将剪碎的乳腺组织用 1双抗的灭菌 PBS 缓冲液清洗 2-3 次，去除组织中牛奶等杂质，然后取适量移入 10ml 锥底刻度离心管中，加入3 倍体积（ v/v）的 0.5%的型胶原酶溶液，置于 37、 5%CO2 饱和的培养箱中，消化处理1-1.5h，其中每间隔 20min 取出震荡一次，以使组织块彻底消化为单细胞悬液。 消化好的组织样品用 100 目（孔径）的灭菌尼龙滤网过滤，收集细胞滤液于 10ml 锥底刻度离心管中，用 1双抗的灭菌 PBS 缓冲液稀释至最大刻度处，于 128g 离心 8min，弃去上清液，分别用表 1 中的生长培

10、养基和乳腺上皮专用培养基悬浮所得细胞沉淀，然后分别接种于 25ml 一次性细胞培养瓶中，于 37、 5%CO2 饱和的培养箱中进行培养，用倒置相差显微镜每 2 天观察一次细胞生长情况。 2.2.3 奶牛乳腺上皮细胞的分离纯化 由于所取样品为乳腺组织，在原代培养的消化过程中，所得为乳腺上皮细胞和成纤维细胞的混合物，因此在培养过程中需要进行乳腺上皮细胞 的分离纯化，以得到纯的乳腺上皮细胞。具体方法如下：待原代培养的细胞生长到 80 90%汇合时，用胰蛋白酶 /EDTA 消化液于 37下消化细胞，待大部分细胞收缩变圆时，向培养液中加入终止培养基终止消化，然后用弯头吸管轻柔吹打培养液，使细胞全部消化下

11、来，悬浮于培养液中。将消化好的单细胞悬液移入 10ml 锥底刻度离心管仲，于 128g 离心 8min，使细胞沉淀，然后用 PBS 缓冲液清洗沉淀一次，上述条件离心，弃去上清液，最后用生长培养基悬浮所得细胞沉淀，用弯头吸管轻柔吹打约 50 次，制成单细胞悬液。 将单细胞悬液用血球计数板进 行细胞计数，以 1 105 细胞 /ml 的浓度接种于 25ml 一次性细胞培养瓶中，置于 37、 5%CO2 饱和的培养箱中静置 10-15min，以使成纤维细胞贴壁，分离上皮细胞。待静置完成后，取出培养瓶于倒置相差显微镜下观察细胞的贴壁情况，将未贴壁的细胞连同培养液一起移入 75ml 一次性细胞培养瓶中，

12、于 37、 5%CO2 饱和的培养箱中传代培养，每天观察一次细胞生长情况。已贴壁细胞多为成纤维细胞，弃去不要。待传代培养的细胞生长到 80 90%汇合时，重复上述操作 4-5 次，直至观察到汇合的细胞 90%以上为上皮细胞为止，说明得到 纯化的上皮细胞，可以用于后续的试验操作。 本研究中，采用两种不同的培养基进行原代培养（ DMEM/F12 和乳腺上皮细胞专用培养基），在试验中只对 DMEM/F12 培养的上皮细胞进行分离纯化，乳腺上皮细胞专用培养基培养的细胞直接进行传代培养，采用第 2 代培养细胞即可进行后续试验。 2.2.4 奶牛乳腺上皮细胞的三维培养 奶牛乳腺上皮细胞的三维培养参照 De

13、bnath 等（ 2003）的方法进行 10。 （ 1）三维培养基质胶原的准备 将 Matrigel 按说明书要求进行处理，然后用移液器将 Matrigel 加入 96 孔细胞 培养板内，每孔加入 50 l，上述操作均在冰上进行。然后将 96 孔板置于 37约 30min 使胶凝固，取出备用。 （ 2）上皮细胞的准备 将纯化的奶牛乳腺上皮细胞（ DMEM/F12 培养基和乳腺上皮专用培养基培养）进行消化，方法同上，再制取单细胞悬液，采用分析培养基对细胞进行稀释。然后进行细胞计数，分别制成 1 104 细胞 /ml、 1 105 细胞 /ml 和 1 106 细胞 /ml 的细胞悬液，备用。 （

14、 3）上皮细胞的接种 将上述已知浓度的上皮细胞悬液接种于包被了 Matrigel 的 96 孔板中，每孔加样量为 160 l，每个浓度接种 6 孔（其中两种培养基所培养细胞各接种 3 孔），作为重复样品。然后将96 孔板置于 37、 5%CO2 饱和的培养箱中进行培养，开始培养时为第 0 天，每 4 天换液一次，换液所用培养基也为分析培养基，同时用倒置相差显微镜观察细胞生长状况，第 16 天结束培养。 2.2.5 三维培养奶牛乳腺上皮细胞的荧光染色及观察 将培养结束后的 96 孔板取出，用 DAPI 直接在孔板内进行染色，于荧光显微镜下观察乳腺上皮细胞三维生长的状况。 3 结果与分析 3.1

15、奶牛乳腺上皮细胞的原代培养 奶牛乳腺上皮细胞的原代培养结果见图 1。图 1 中 A 和 B 分别为 采用 DMEM/F12 和乳腺上皮细胞专用培养基进行原代培养的结果。 由培养结果可知，对于 DMEM/F12 培养基，细胞形态主要为成纤维细胞，中间伴随着少量的乳腺上皮细胞。成纤维细胞形成多极或双极形态，而上皮细胞形成铺路石样的形态。因此，在此培养条件下，混合生长的细胞需要进行纯化才可以获得较纯的满足试验要求的乳腺上皮细胞。而乳腺上皮专用培养基培养的细胞 90%以上为上皮形态的细胞，说明乳腺上皮专用培养基限制了成纤维细胞的生长，只适合上皮细胞生长，纯度可以满足后续试验需要。 且两种培养基 对细胞

16、的生长速度也有不同影响，采用 DMEM/F12 培养基进行奶牛乳腺上皮细胞的原代培养，细胞生长较快，大约在培养的 5-6 天达到约 90%汇合，可以进行传代培养。而采用乳腺上皮专用培养基进行原代培养时，细胞生长速度较前者慢，约在 7-8 天才达到约70%汇合，说明乳腺上皮专用培养基在抑制成纤维细胞生长的同时，使上皮细胞的生长也受到一定程度的限制。这种现象可能与培养基的组成有关，我们在采用 DMEM/F12 培养基进行培养时，向培养体系中加入了 10%的胎牛血清，以促进细胞的贴壁和生长。而乳腺上皮专用培养基属于无血清培养基 ，失去了血清中某些蛋白和因子对细胞的保护、促进作用 11，可能影响了细胞

17、的生长速度。 3.2 奶牛乳腺上皮细胞的分离纯化 试验结果见图 2。 图 2 为经过 4 代纯化培养的奶牛乳腺上皮细胞，培养基为 DMEM/F12。通过分离纯化后，乳腺上皮细胞的比例约占到总细胞数的 90%以上，可以满足后续的试验要求。在对乳 A DMEM/F12 培养基 A DMEM/F12 medium B 乳腺上皮专用培养基 B mammary epithelial cell medium 图 1 奶牛乳腺上皮细胞原代培养结果 Figure 1 Bovine mammary epithelial cells in primary culture 图 2 分离纯化后的奶牛乳腺上皮细胞 Fi

18、gure 2 The purified bovine mammary epithelial cells 腺上皮细胞分离纯化时，我们采用差速贴壁法进行。即利用成纤维细胞和上皮细胞的贴壁时间不同，成纤维细胞先于上皮细胞贴壁的特点，使消化后的混合细胞悬液，在 37停留15-30min，使大 部分成纤维细胞贴壁。而此时上皮细胞仍然悬浮于培养基中，将这些含有大 量上皮细胞的培养液另外进行培养，就实现了上皮细胞与成纤维细胞的部分分离。本研究的结果显示，在经过 4 次差速贴壁的纯化后，可以达到纯化上皮细胞的目的。相关资料报道，上皮细胞与成纤维细胞的分离纯化需要经过 5-7 代的传代，本试验传代次数较之减少，

19、可能与培养基配方及动物品种差异等因素有关。 3.3 奶牛乳腺上皮细胞三维培养的形态观察 试验结果见图 3、图 4。 图 3 为培养第 8 天时倒置相差显微镜观察结果，其中 A、 B 和 C 分 别为不同细胞接种浓度的细胞生长形态。其中，细胞接种浓度为 1 104 细胞 /ml 和 1 105 细胞 /ml 时，培养于Matrigel 上的乳腺上皮细胞形成了与单层培养明显不同的形态。单层培养的乳腺上皮细胞呈现出快速增殖的特性，培养 3 天（ DMEM/F12）或 4 天（乳腺上皮专用培养基）后就达到约100%汇合，而且形成了典型的铺路石样的上皮细胞形态（见图 2）。而三维培养的乳腺上皮细胞则形成

20、了许多团块状的结构，这种结构与相关文献报道的三维细胞培养结果相似 10,12，类似于体内正常的腺泡结构。 图 4 为培养结束，用 DAPI 染 色后于荧光显微镜下观察的结果。在显微镜下可观察到乳腺上皮细胞聚集在一起形成团块，且内层的细胞有凋亡现象，说明乳腺上皮细胞开始出现极化，形成具有中空腔状的腺泡结构。本试验中经过 16 天的培养，形成了较为完整的腺泡结 构。但当细胞接种浓度达到 1 106 细胞 /ml 时，细胞层叠堆积在一起，生长密度非常大，在显微镜下观察不到单个细胞的生长形态。这一结果说明不同的细胞接种浓度对于三维条件下细胞的生长影响较大，摸索较为适宜的细胞接种浓度对乳腺上皮细胞三维培

21、养体系的建立是图 3 奶牛乳腺上皮细胞三维培养结果（培养第 8 天） Figure 3 Bovine mammary epithelial cells in three-dimensional culture(the 8th day,) A 细胞接种密度 1 104细胞 /ml A The cells plated at 1 104 /ml B 细胞接种密度 1 106细胞 /ml B The cells plated at 1 105 /ml C 细胞接种密度 1 106细胞 /ml C The cells plated at 1 106 /ml 图 4 奶牛乳腺上皮细胞三维培养荧光显微镜观

22、察结果（培养第 16 天） Fifure 4 Bovine mammary epithelial cells in three-dimensional culture under fluorescence microscope(the 16th day) A 细胞接种密度 1 104细胞 /ml A The cells plated at 1 104 /ml B 细胞接种密度 1 105细胞 /ml B The cells plated at 1 105 /ml D 细胞接种密度 1 106细胞 /ml D The cells plated at 1 106 /ml C 细胞接种密度 1 10

23、5细胞 /ml C The cells plated at 1 105 /ml 比较关键的一步。本研 究结果显示，当细胞接种浓度为 104 105 细胞 /ml，可以得到较为理想的三维培养结果。 4 讨论 4.1 不同培养基对奶牛乳腺上皮细胞生长的影响 多年来， Eagles 低限量培养基（ MEM）已成为所有培养基中常用的一种， Dulbecco 改良的 MEM 培养基（ DMEM）是为小鼠成纤维细胞设计的， F12 是为在低血清浓度下克隆CHO 细胞而设计的。 F12 的营养浓度低，适合于克隆化培养，而 DMEM 营养成分浓度高，适合于高细胞密度、大量繁殖的培养情况。因此，经过改良配制的

24、DMEM/F12 融合了 F12营养成分多样而 DMEM 营养浓度高的特点，得到广泛使用，可以满足许多不同类型细胞的生长需求 11。 血清中含有各种生长因子，可以促进细胞的繁殖及贴壁。其中，血清中的血小板生长因子（ PDGF）是具有有丝分裂原活性的多肽类物质，可能是血清中的主要生长因子，能够刺激成纤维细胞的生长 11。用 DMEM/F12 培养基并添加血清进行培养时，可能更多地促进成纤维细胞的生长，抑制乳腺上皮细胞的生长，本试验中在原代培养中出现的成纤维细胞生长较多，乳腺上皮细胞生长不足的现象也说明了这点。我们采用的乳腺上皮专用培养基是一种商业化的用于乳腺上皮细胞 生长的选择性无血清培养基，其

25、最主要的优点就是可以有效抑制成纤维细胞的过度生长，促乳腺上皮细胞的生长 11。因此，试验中采用乳腺上皮专用培养基进行奶牛乳腺上皮细胞的培养时，得到了纯度较高且细胞密度较大的细胞数量，完全可以满足后续的试验要求。但乳腺上皮专用培养基价格较为昂贵，如果大量使用，会增加试验费用，而采用 DMEM/F12 培养基，经过 5-7 代纯化后，也可得到纯度较高的奶牛乳腺上皮细胞，同时费用较前者低 3-4 倍。综合比较，乳腺上皮专用培养基培养时间短，细胞活力高，变异较小，具有较大的优势。 4.2 奶牛乳 腺上皮细胞三维培养体系的建立 细胞在胞外基质成分的作用下，形成特定的类似于体内的三维腺泡结构，区别于二维培

26、养上皮细胞的典型铺路石样形态，而且细胞也具有了合成和分泌酪蛋白的能力 13,14,15,16,1。因此，我们可以利用这样的三维细胞培养体系，有效研究营养物质供给对乳腺上皮细胞内乳蛋白及乳脂肪合成的影响。乳腺上皮细胞三维培养体系的建立，受到多种因素的影响，如不同的培养基质、细胞接种密度、培养方式及培养时间等。 体内乳腺上皮细胞周围的基质膜主要是由一些基质胶原组成的，如层粘连蛋白、整联蛋白及胶原等。目前体 外 培 养 中 最 常 用 的 外 源 性 基 质 胶 原 是 来 自 小 鼠 肉 瘤 的Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)，它是一种基质混合物，包含有许多基质成分，如胶原、层

27、粘连蛋白、触觉蛋白及其它重要的生长因子 17，并已实现商品化生产，其商品名为 Matrigel。虽然 Matrigel 含有乳腺上皮细胞生长所需要的许多基质成分，但其直接分离自生物组织，对不同物种细胞生长可能会造成一定影响，而且昂贵的价格也限制了其应用范围。因此，一些研究者采用型胶原或鼠尾胶原进行三维培养的尝试，而且许多人工合成的生物质材料如聚丙烯酰胺凝胶等也被 用于细胞三维培养的研究 19。本研究使用 Matrigel 作为奶牛乳腺上皮细胞三维培养的基质胶原，培养效果较为理想，但 Matrigel 价格较高，不适合于大量细胞的三维培养，在今后的研究中可以尝试其它基质材料的应用。 对三维培养来

28、说，不同的研究者采用的细胞接种数量差别较大 19,10,14，且不同的细胞其接种密度也有不同的要求 19，这可能与细胞的种类及在基质胶原中的培养方式有关。在进行三维培养时，应考虑不同细胞的生长特性，选择合适的细胞接种密度，以达到细胞三维生长的最佳状态。例如，正常的人乳腺上皮细胞与 恶性乳腺肿瘤细胞在 EHS 中的接种密度就有较大差别，正常细胞要大于恶性肿瘤细胞 19。在模拟体内环境的过程中，必须考虑细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用，包括细胞之间通过一些特异的基质成分如层粘连蛋白等传递信号，以使乳腺上皮细胞能够表达特定的蛋白或分泌产物 20。当细胞接种密度太低时，细胞没有足够的数量，可能会导

29、致细胞间缺乏应有的相互协同作用，不利于细胞的生长和分化，从而不能形成有效的具有分泌功能的培养体系。但细胞接种数量太多时，又会使细胞在培养基质内层层叠加，影响细胞的生长速度，形成大小不一的细胞，不 利于单个细胞的分析和形成分泌功能稳定的培养体系。本研究选择三种不同的细胞接种浓度，当细胞接种浓度为 104 105 细胞 /ml，能够获得较为理想的三维培养结果。 本研究采用的培养方式为基质胶原顶部培养（ on-top culture），不同于传统的植入式三维培养（ 3D embedded culture）。植入式培养中，细胞随机分布于基质胶原内，导致细胞过多叠加，影响细胞的生长 18，且细胞完全处于

30、胶原内生长，受到胶原阻力较大，细胞生长困难，生长状态不好，因此需要接种的细胞数量很大。此外，用于三维培养的基质胶原如Matrigel 等均价格昂贵，采用植入式培养，会消耗大量 Matrigel，不适合于大量细胞的三维培养 10,17。而顶部培养恰好弥补了植入式培养的不足，不但节约基质胶原的用量，而且细胞在生长过程中部分伸展进入胶原内，部分向上伸展生长，阻力较小，更利于细胞腺泡结构的形成。 三维培养中，培养时间对乳腺上皮细胞三维结构的形成也是较为关键的影响因素 10,12。由于每个极化的腺泡结构都是由一个上皮细胞分化而来的 12，因此，在培养期间，细胞需要经过一系列的增殖和形态变化，然后形成由一

31、层极化的上皮细胞围绕着一 个中空腔的腺泡结构。这种腺泡结构的形成需要一定的时间，一般在培养的 0-5 天，细胞不断增殖，形成许多细胞聚集的细胞团块； 5-8 天内细胞团块外层与基质胶原接触的细胞发生极化，而团块内部的细胞由于缺乏与基质胶原的接触而不发生极化，因而逐渐凋亡并最终死亡。在这一期间开始出现腺泡结构，并在之后的 7-8 天内不断完善，培养到大约第 16 天时，完整的乳腺上皮细胞的三维腺泡结构就形成了 12。本研究虽然没有检测培养期间奶牛乳腺上皮细胞的形态变化，但在 16 天的培养之后，出现了类似的腺泡结构。有研究者的报道中培养时间较短21,1，可能与细胞的种类、培养方式及接种密度的不同

32、有关。 5 结论 本研究采用纯化的奶牛乳腺上皮细胞，以 Matrigel 为培养基质，进行奶牛乳腺上皮细胞的三维培养。经过 16 天的培养，当细胞接种密度为 1 104 105 细胞 /ml 时，观察到具有中空腔状结构的乳腺腺泡形态。这一结果表明利用合适的培养基质，可以建立能够模拟体内结构的奶牛乳腺上皮三维培养体系。 参考文献 1 E.B. Kabotyanski, M. Rijnkels, et al. Lactogenic hormonal induction of long-distance interactions between -casein gene regulatory ele

33、ments. The Journal of Biological Chemistry, 2009;(6):1-20 2 C.D. Roskelley, A. Srebrow, et al. A hierarchy of ECM-mediated signalling regulates tissue-specific gene expression. Curr Opin Cell Biol 1995;5:736747. 3 Y. Kadoya, S.Yamashi. Salivary gland morphogenesis and basement membranes. Anat Sci In

34、t 2005;2:7179. 4 L.E. OBrien, T.S. Jou, et al. Rac1 orientates epithelial apical polarity through effects on basolateral laminin assembly. Nat Cell Biol 2001;9:831838. 5 A.S. Yap, B.R. Stevenson, et al. Cadherin-mediated adhesion and apical membrane assembly define distinct steps during thyroid epit

35、helial polarization and lumen formation. Endocrinology 1995; 10:46724680. 6 B.L.Larson. Comparative production of -lactoglobulin and orotic acid with lactose in bovine mammary cell culture: effects of density and constituent inhibition. J. Dairy Sci., 1976;59:1881-1889 7 D.D.S. MacKenzie, I.A. Forsy

36、th, et al. Culture of bovine mammary epithelial cells on collagen gels. Tissue cell,1982;14:231-241 8 M.F.McGrath. A novel system for mammary epithelial cell culture. J. Diary Sci., 1987;70:1967-1980 9 OBrien LE, Zegers MM, et al. Opinion: Building epithelial architecture: Insights from three-dimens

37、ional culture models. Nat Rev Mol Cell Biol., 2002; 7:531537. 10 J. Debnath, S. K. Muthuswamy, et al. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods, 2003;30:256-268 11 R.I.弗雷谢尼著，张静波，徐存拴等译 . 动物细胞培养 基本技术指南，北京：科学出版社， 200

38、8 12 M. Kozlowski, M. Gajewski, et al. Differences in growth and transcriptomic profile of bovine mammary epithelial monolayer and three-dimensional cell cultures. Journal of Physiology and Pharmacology, 2009;Suppl 1:5-14 13 C. M. Stiening, J. B. Hoying, et al. The effects of endocrine and mechanica

39、l stimulation on stage 1 lactoogenesis in bovine mammary epithelial cells. J. Dairy Sci., 2008;91:1053-1066 14 S. Delabarre, C. Claudon, et al. Influence of several extracellular matrix components in primary cultures of bovine mammary epithelial cells. Tissue Cell, 1997;29(1):99-106 15 R.S. Talhouk,

40、 R.L. Neiswander, et al. Effect of substratum on growth, cell morphology and lactoferrin synthesis and secretion in bocine mammary cell culture. Tissue Cell, 1998;30(2):226-235 16 K.K. Menzies, C. Lefevre, et al. Insulin regulates milk protein synthesis at multiple levels in the bovine mammary gland

41、. Funct Integr Genomics, 2009;9:197-217 17 T.R. Sodunke, K.K. Turner, et al. Micropatterns of Matrigel for three-dimensional epithelial cultures. Biomaterials, 2007;28:4006-4016 18 R. J. Kandice, L. L. Jennifer, et al. CHAPTER 23 Demystifying the Effects of a Three- Dimensional Microenvironment in T

42、issue Morphogenesis. Methods Cell Biol. 2007 ; 83: 547583 19 G.Y. Lee, P.A. Kenny. Et al. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods, 2007;4(4):359-365 20 G.S.Zoubiane, A. Valentijn, et al. A role for the cytoskeleton in prolactin-dependent mamma

43、ry epithelial cell differentiation. Journal of Cell Science, 2004;117(2):271-280 21 Y. Itahana, M. Piens, et al. Regulation of Clusterin Expression in Mammary Epithelial Cells. Exp Cell Res., 2007;313(5):943-951 THE THREE-DIMENSIONAL CULTURES OF BOVINE MAMMARY EPITHELIAL CELLS Wang Xiumei1, Kao Guil

44、an1, Gao Aiwu2*, Hou Xianzhi1, Gao min3 (1 College of animal science and medicine, 2 College of food science and engineering , Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot China 010018; 3 Inner Mongolia Academy of Agriculture and Animal Husbandry, Hohhot China 010010) Abstract: The three-dimension

45、al cultures of bovine mammary epithelial cells were conducted with Matrigel. The density of the cells plated in cell culture plates were respectively 1104cells/ml , 1105cells/ml and 1106cells/ml. After 16 days culture, the cell were stainned with DAPI and the cell morphology were detected by fluores

46、cence microscope. The results suggested that the cells underwent series growth and formed acinar structures described as mammospheres. Key Words: bovine mammary epithelial cell, three-dimensional culture, matrix 作者简介： 王秀美，女，蒙古族， 1983 年 11 月生。内蒙古农业大学动物科学与医学学院动物营养与饲料科学专业硕士研究生。主要从事奶牛营养调控与分子营养学领域的研究工作。 通讯作者： 高爱武，女，汉族， 1969 年 7 月生。内蒙古农业大学食品科学与工程学院教师，副教授，博士。主要从事食品营养与 生物技术领域的教学与研究工作。 项目经费来源： 农业部“奶牛产业技术体系”项目子课题，项目编号： nycytx-02-05