毛蚶多糖（ASLP）免疫调节作用的研究.doc

1、 作者：王莉 (1983.07)，女，江苏，硕士，生物化工 专业， E-mail： *通讯作者：姚全胜，男，教授，博士生导师， E-mail： YaoQStom.Com 毛蚶多糖 （ ASLP） 免疫调节作用的研究 王莉 1，何赟绵 2，姚全胜 *3 (1南京工业大学，江苏，南京 210009； 2中国药科大学，江苏，南京 210009；3江苏省药物安全评价中心，江苏，南京 210009) 摘要 ： 目的 ：研究毛蚶多糖 （ ASLP） 对正常小鼠免疫功能的影响。 方法 ： 通过体外 方法 研究毛蚶多糖 （ ASLP） 对脾淋巴细胞和对 T、 B 淋巴细胞增殖能力的影响以及淋巴细胞产生 IL

2、-2 的影响；体内研究小鼠体重、脏器指数和碳廓清能力以及 ConA 诱导脾淋巴细胞转化的能力来观察毛蚶多糖 （ ASLP） 对小鼠免疫功能的影响。 结果 ：体外试验中，毛蚶多糖 （ ASLP） 增强淋巴细胞的增殖能力以及 IL-2 的活性，与对照组有显著性差异（ P0.05， P0.01）；体内试验中，中、高剂量组的脏器指数和吞噬指数、校正吞噬指数以及淋巴细胞转化率与对照组相比有明显差异（ P0.05， P0.01）。 结论 ：毛蚶多糖 （ ASLP） 对小鼠的免疫功能一定的调节作用，是一种良好的免疫调节剂。 关键词： 毛蚶；多糖；免疫调节；淋巴细胞；碳廓清 Studies on Immuno

3、modulation of Polysaccharide from Arca subcremata Lischke Wang Li1， He Yun-mian2， Yao Quan-sheng3* (1.Nanjing University of Technology,Nanjing210009,China;2.China Pharmaceutical University, Nanjing210009,China; 3. Jiangsu Center for Safety Evaluation of Drugs, Nanjing210009, China ) Abstract: OBJECT

4、IVE: Study the effects of Polysaccharide from Arca subcremata Lischke(ASLP) on immune in normal mice. METHODS： Study the cell multiplication of splenic lymphocyte and T、 B lymph cell in vitro. Investigate the body weight、 the index of immune organs and carbon granula test to determine effects of ASL

5、P on immune function in vivo. RESULTS: In vitro teststhe ASLP can enhance the ability of cell multiplication of splenic lymphocyteand T、 B lymph cell, higher than that of ctrol group(P0.05,P0.01). In vivo tests the the index of immune organs and the .The macrophage engulfing carbon granula ability i

6、n middle and high dosage treatment are higherthan the control group(P0.05,P0.01). CONCLUSION: The results indicate2 d that the ASLP could improve the immunological function of mice. It would be a good immunomodulater. Key words: Arca subcremata Lischke; Polysaccharide; immunomodulation; lymphocyte;

7、engulfing carbon granula 毛蚶 (Arca subcremata Lischke)属于软体动物门、瓣鳃纲、翼形亚纲、蚶目、蚶科 ， 毛蚶属 ， 俗称毛蛤、麻蚶、瓦楞子等 ,广泛分布于日本、朝鲜、中国沿岸。在中国北起鸭绿江 ,南至广西均有分布 ， 以莱州湾、渤海湾、辽东湾、海州湾等浅水区资源尤为丰富 1。 毛蚶其壳和肉皆有药用价值。中医学上认为它具有健胃、温中、益血、消瘕化食、散淤、润五脏、利关节等作用，毛蚶多糖 （ ASLP） 是毛蚶具有免疫增强作用和抗肿瘤作用的的活性成分。 本文 从体内和体外两个方面讨论了毛蚶多糖 （ ASLP） 的免疫学作用，为进一步研究毛蚶的药用

8、价值，深入开发海洋药用资源打下了基础。 1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 仪器 恒流泵 HL-2(上海沪西分析仪器厂 )，自动部分收集器 BSZ-100 型 (上海沪西分析仪器厂 )， CO2 培养箱 (美国 ThermoForma 公司 )，循环水真空泵 (郑州长城科工贸有限公司 )，旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器厂 )，冷冻离心机 (日本 HITACHI 公司 )，DG5032 型酶联免疫检测仪 (美国 Bio-Rad 公司 )， UV2000 型分光光度计 （尤尼 柯仪器有限公司） 1.1.2 试剂 小牛血清 (Hyclone，南京生兴生物工程有限公司 )； DEAE-52

9、阴离子交换柱(Whatman)；刀豆蛋白 A(Con A， Sigma)；噻唑蓝 (MTT， Sigma)， RPMI-1640(Gibco)培养液 (含 10%的小牛血清 ,青、链霉素各 100 U ml-1)；其他试剂均为分析纯。 1.1.3 动物： 8 周龄 ICR 小鼠，南京医科大学， 202g，清洁级 ，批号： SCXKC苏 72008-004 1.1.4 毛蚶多糖的提取与纯化 采用水提醇析法，毛蚶粉碎匀浆，用丙酮脱色干燥， 80 水浴浸提（ 3 次），3 Sevag 法脱蛋白，离心，乙醇沉淀，洗涤冷冻干燥， DEAD-52 柱层析， Sephadex G-200 柱层析，透析浓缩，

10、冷冻干燥，得到纯品 毛蚶多糖 （ ASLP），供实验室用。 1.2 实验方法 1.2.1 毛蚶多糖 （ ASLP） 对脾淋巴细胞增殖能力的影响 采用 MTT 法测定小鼠脾淋巴细胞增殖能力，无菌制备脾淋巴细胞悬液，用含 10%小牛血清的 RPMI-1640 培养液调整细胞浓度为 6-8106ml-1。于 96 孔培养板中，每孔加入 100l 细胞悬液，再加 100l 培养液（空白对照）、 10g ml-1ConA（阳性对照）及含有不同浓度的样品溶液（ 400g ml-1-1000g ml-1），置 5%CO2 37 培养 48h。培养结束前 4h， 于每孔加入 5mg ml-1 的 MTT 20

11、l，培养结束后，每孔加入 DMSO100ul，于酶标仪 570nm 处测 OD 值，计算增殖指数 SI 2。 SI= 样品孔的吸光值 阴性对照孔的吸光值 1.2.2 毛蚶多糖 （ ASLP） 对 T、 B 淋巴细胞增殖的影响 采用参考文献 4 中的方法分别提取 T、 B 细胞悬液，用 MTT 法测定 T， B淋巴细胞增殖能力，用培养液作为空白对照、 10g ml-1Con A 及 10g ml-1LPS作为阳性对照，在酶标仪 570nm 测各孔 OD 值，计算增殖指数 SI3。 表 1 毛蚶多糖 （ ASLP） 对脾淋巴细胞以及 T、 B 淋巴细胞增殖能力的影响（ n=6， xs ） Tab

12、1 The effect of ASLP on proliferation of splenocyte, B cells and T cells in mouse spleen. （ n=6， xs ） Group Positive LPS/ 5 1g ml ConA/ 10 1g ml ASLP/ 1g ml 800 400 200 100 splenocyte 3.50 0.15 1.600.18 2.600.18 3.50 0.15 * 3.22 0.16 * 3.00 0.13 * 2.44 0.11 B cell 1.00 0.14* 3.61 0.15 * 1.23 0.11 3.

13、22 0.12 * 2.84 0.16 * 2.42 0.12 * 1.62 0.11 * T cell 1.00 0.10 1.32 0.11 2.910.13 3.44 0.10 3.18 0.11 2.82 0.14 2.60 0.12 注： 与对照组比较有显著性差异 （ P0.01） ； *与 Con A 比较有显著性差异 （ P0.01） ； 与LPS 比较有显著性差异 （ P0.01） 。 Compared with control group(P0.01), * Compared with 4 Con A(P0.01), Compared with LPS(P0.01) 测定结果

14、见表 1， 毛蚶多糖（ ASLP） 体外能明显刺激并促进小鼠脾淋巴细胞的增殖，并且其作用随着多糖浓度的变化而不同。在 100g ml-1-800g ml-1的浓度范围内，随着多糖浓度的上升，其刺激作用不断的增强，说明毛蚶多糖（ ASLP） 对脾淋巴细胞增殖活性有明显的剂量依赖性。 由于 Con A 和 LPS 分别只能刺激 T 和 B 细胞，因此可将分离 到的 T、 B 细胞分别用 Con A 和 LPS 刺激来考察分离效果 ,其中不同浓度的 ASLP 对小鼠脾脏的 T、 B 淋巴细胞具有显著的刺激增殖的作用，并且在 100g ml-1-800g ml-1这一剂量范围内， T， B 淋巴细胞的

15、增殖作用随 毛蚶多糖（ ASLP） 的剂量的变化而变化，说明 T， B 淋巴细胞的增殖对剂量有一定的依赖性。 1.2.3 毛蚶多糖 （ ASLP） 对小鼠脾细胞产生 IL 2 的影响 1） IL 2诱生 无菌制备小鼠脾淋巴细胞悬液，用 RPMI-1640完全培养液配成1107 ml-1，每孔加入 3g ml-1的 ConA和不同浓度的 ASLP溶液 100l，每组设 4 6个复孔，置于 5 CO2 37 培养箱中孵育 48h，离心吸取上清，即为 IL-2代测样。 2） IL-2活性检测 常规制备小鼠胸腺细胞细胞悬液，调整浓度为 1107ml-1内含3g ml-1的 ConA 1ml，吸取细胞悬

16、液加置 96孔板， 100l 孔 -1。然后加入制备的 IL-2代测上清，并设阳性对照，阴性对照，置 5 CO2 37 培养箱中培养 72h，每孔加入 20l MTT，继续培养 4h，吸弃上清每孔 100l，加入 100l 孔 -1二甲基亚砜，振荡 5min，于酶 标仪 492nm处测 OD值 4-5。 表 2 毛蚶多糖 （ ASLP） 对脾淋巴细胞 IL-2 的影响 （ n=6， xs ） Tab 2 The effect of ASLP on Spleen lymphocytes generate IL-2（ n=6， xs ） 与对照组比较有显著性差异 （ P0.01） 。 Compar

17、ed with control group(P0.01)。 1.2.4 小鼠体内免疫实验 剂量选择，设计了高、中、低 3 个剂量组（ 10 只），即小鼠每日每只口服给Group positive control ASLP/ 1g ml 800 400 200 100 IL-2/A570 0.3020.006 0.354 0.015 3.22 0.16 0.302 0.017 0.244 0.011 5 予毛蚶多糖 （ ASLP） 200mg kg-1（高剂量）、 100mg kg-1（中剂量）、 50mg kg-1（低剂量），对照组口服生理盐水，连续给药 15d。 1) 免疫器官胸腺、脾脏指数

18、的测定 最后一次给药后，颈椎脱臼处死小鼠，称重，取出小鼠脾脏、胸腺称重，并计算脏器指数。 脏器指数（）脏器重量（ g） /动物重量（ g） 100 表 3 毛蚶多糖 （ ASLP） 对小鼠体重及脏器指数的影响 （ n 10， xs ） Tab 3 The effect of ASLP on the weight and index of immune organs in mice(n=10, xs ) Group Dose / 1mg kg Weight /g Thymic index / 1mgg Spleen index / 1mgg Control group Sodium Chlori

19、de 28 5.22 2.92 0.49 4.12 0.79 Low dose group 50 25.8 2.57 3.18 1.05 4.18 0.66 Middle dose group 100 26.5 3.37 3.23 0.97 4.21 0.44 High dose group 200 26.5 2.42 3.11 0.59 4.38 0.38 与对照组比较有统计学差异 （ P0.05） 。 Compared with control group(P0.05) 喂养 15d 后，毛蚶多糖 （ ASLP） 对小鼠的体重无明显影响，对小鼠的免疫器官的脏器指数的影响在中、高剂量时有较为

20、显著性的差异 （ P0.05） ，见表 3。 2) 小鼠碳廓清试验 试验动物给药 15 天后，按 0.1ml/10g 体重计算，小鼠尾静脉注射印度墨汁（用生理盐水稀释 5 倍），分别在注射 2min、 10min 从眼眶静脉丛取血 20l，加入到 2ml 0.1 Na2CO3 溶液中，以 Na2CO3 溶液作空白， 600nm 波长比色测 OD值，并将小鼠处死，取肝脏、脾脏称重。计算吞噬指数（ K）及校正吞噬指数（ a） ,表示小鼠碳廓 清的能力 5。 吞噬指数 K logA112tt logA2，校正吞噬指数 a= 3 K体 重肝 重 脾 重6 K：直线斜率，可表示吞噬速率； a：反映每单位

21、组织重量的吞噬活性 表 4 毛蚶多糖 （ ASLP） 对小鼠碳廓清能力的影响（ n 10， xs ） Tab 4 The effect of ASLP on engulfing carbon granula ability in mice(n=10, xs ) Group Dose / 1mg kg Phagoccytosis index/K Revised phagocytosis index/a Control group Sodium Chloride 0.027 0.008 3.05 0.38 Low dose group 50 0.029 0.009 5.15 1.04 Middle

22、 dose group 100 0.032 0.006 5.58 0.74 High dose group 200 0.030 0.004 5.43 0.56 与对照组比较有统计学差异 P0.05 ， 与对照组比较有显著性差异（ P0.01）。 Compared with control group(P0.05/P0.01) 从表 4 可以看出，喂养 15d 后，毛蚶多糖 （ ASLP） 的高、中剂量组的吞噬指数和校正吞噬指数与对照组均有比较显著性的差异（ P0.05/P0.01），表明毛蚶多糖能增强巨噬细胞的吞噬功能，加速碳粒的清除。 3) ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验 于末次给药

23、后次 日脱颈处死动物，称重，无菌取出脾脏，在 200 目不锈钢筛上轻轻研磨过网，制成脾细胞悬液。用 Hanks 洗涤 3 次，用含 10%小牛血清的RPMI-1640 制成 2106ml-1 的脾细胞悬液 ,将每只小鼠的细胞悬液分两孔加入 24孔培养板中，每孔 1ml。其中一孔加入 Con A（ 5g ml-1） 50L，另一孔作为对照组，置 5%CO2， 37 培养 72h，培养结束前 4h，每孔轻轻吸去上清 0.7ml，加不含小牛血清的 RPMI-1640 培养液 0.7ml，同时加 MTT（ 5mg ml-1） 50l孔-1，继续培养 4h。加入 DMSO 1ml 裂解细胞，吹打紫色结晶

24、使之完全溶解，在570nm 处测定吸光值（ A570） 6。 从表 5 毛蚶多糖 （ ASLP） 在高、中剂量组时，能促进脾淋巴细胞的转化能力，与对照组有显著性差异（ P0.05/P0.01）。 7 表 5 毛蚶多糖 （ ASLP） 对小鼠脾淋巴细胞转化能力的影响 Tab The effect of ASLP on spleen lymphocytes induced by ConA in mice (n=10, xs ) Group Dose / 1mg kg Spleen lymphocyte proliferation(A570) Control group Sodium Chlorid

25、e 0.1430.04 Low dose group 50 0.1630.06 Middle dose group 100 0.2060.06 High dose group 200 0.2630.10 与对照组比较有统计学差异 P0.05 ， 与对照组比较有显著性差异（ P0.01）。 Compared with control group(P0.05/P0.01) 1.3 统计处理 数据均以均数 标准差 (XS)表示，采用单因素方差分析 (ANOVA)和 t 检验采用 Statistica 6.0 对数据进行处理。 P0.05 为有统计学意义， P0.01 为有显著性差异。 2 讨论 据文

26、献报道，有各种不同来源的多糖对机体的免疫功能都有不同程度的增强促进作用。多糖不仅能有效的激活免疫细胞、提高机体的免疫能力，而且对正常宿主细胞没有直接的毒副作用 7。 胸腺和脾脏是体内的主要免 疫器官，与体液免疫和细胞免疫均有密切连续。脾脏以 B 淋巴细胞为主，而 B 淋巴细胞又是调节体液免疫的主要细胞。巨噬细胞参与机体的特异性和非特异性性免疫，具有强大的杀伤和清除作用，还能分泌细胞因子调节免疫，并将抗原提呈给 T、 B 淋巴细胞 8 9。 本试验经过小鼠体内和体外两个方面考察毛蚶多糖 （ ASLP） 对机体的免疫调节作用，证实毛蚶多糖 （ ASLP） 能在体外单独增强小鼠淋巴细胞的增殖能力以及

27、促进 IL-2 的产生，并且随着剂量的增加而增加；体内试验结果显示，毛蚶多糖 （ ASLP） 对小鼠体重没有增强作用，但是高、中剂量的多糖 对小鼠的胸腺指数和脾脏指数有比较明显的增强作用（ P0.05），这样排除了体重的影响，更能说明毛蚶多糖 （ ASLP） 能增加胸腺和脾脏的净重量。并且毛蚶多糖 （ ASLP）8 能显著增强巨噬细胞的吞噬能力，提高机体对病原微生物的抵抗力，增强机体的非特异性免疫。同时还能增加 ConA 诱导的淋巴细胞增殖，大部分的体内免疫试验结果无剂量效应关系，其中中剂量的毛蚶多糖的结果较好，说明毛蚶多糖（ ASLP） 可能在体内有一个最适应效应量，大于这个剂量反而产生免疫

28、抑制作用。因此，体内体外均表明毛蚶多糖 （ ASLP） 能明显提高小鼠的免疫能 力，有一定的免疫增强作用，可增强机体的特异性和非特异性免疫功能，是一种具有良好开发前景的免疫调节剂。 参考文献： 1陈建华 , 阎斌伦 , 高焕 ， 毛蚶生物学特性及其研究进展 J， 河北渔业 , 2006, (09)： 24-26 2何赟绵，陈宇星，刘纯慧等，毛蚶多糖的分离纯化和免疫活性的测定 J，中国海洋药物杂志， 2007， 26（ 2）： 23 26 3徐叔云 , 卞如濂 , 陈修 .药理实验方法学（第三版） M， 人民卫生出版社 , 2002：1456 1488 4刘素君 , 周泽斌 , 胡霞 等， 大蓟

29、总黄酮对荷瘤小鼠白细胞介素 -1和白细胞介素 -2的影响 J， 时珍国医国药 . 2008(02)： 335 337 5宋宁 , 陆瑛 , 邱明华 ， 球花石斛多糖免疫调节作用的研究 J， 天然产物研究与开发 , 2006, (03)： 445 448 6王惠国 ,关洪全 ,赵依娜 ， 鬼毛针多糖对小鼠细胞免疫功能影响的实验研究 J. 中国真菌学杂志 ， 2007(03)： 152 153 7卞俊 , 储智勇 , 鲍蕾蕾等 . 孔石莼多糖对小鼠免疫功能的影响 J， 中国生化药物杂志 , 2006, (05)： 276 279 8邱培勇 , 徐自超 , 陈正跃等 ， 黄芪多糖对小鼠免疫功能的影响 J， 新乡医学院学报 , 2006, (06):585 586 9Xu C, Shen Y, Zhang M, Studies on medicinal Dendrobium identification. China Tradit Herb Drugs, 2004, 35(8): 11-12