烟草中氨基酸分析技术研究进展.doc

1、 1 烟草及烟草制品 游离氨基酸 的 测定 离子色谱 -积分脉冲安培法 标准项目试验报告 山东中烟工业有限责任公司 2012-03 2 目 录 1. 立项背景 4 2. 标准适用范围 9 3. 原理 9 4. 实验方法 9 4.1 仪器 设备 9 4.2 试剂和材料 9 4.3 样品前处理 10 4.4 色谱条件 10 4.5 标准曲线配制及制作 11 4.5.1 标准溶液配制 11 4.5.2 标准曲线制作 12 5. 结果与讨论 13 5.1 前处理 13 5.1.1 萃取方式的选择 13 5.1.2 称样量的选择 13 5.1.3 萃取时间的优化 13 5.2 仪器条件的选择 13 5.

2、2.1 固相萃取小柱选择 13 5.2.2 色谱柱温度的优化 14 5.2.3 进样量的选择 15 5.3 分析参数 15 5.3.1 样品测定结果 15 5.3.2 检测限 16 5.3.3 方法的重复性试验 16 5.3.4 样品回收率 19 5.3.5 与氨基酸分析法比对 21 5.3.6 比对实验 25 6 方法普适性 25 参考文献 26 3 1. 立项背景 氨基酸是烟草中主要的成分之一，它们与烟草的品质密切相关。游离氨基酸是烟叶中的重要化学成分，也是烟草中的一类重要致香前体物质，氨基酸的含量与烟草的品质有着密切的关系，其含量的高低直接影响到烟的味道和烟气的丰满度 1、 2，在烟叶的

3、烘烤、陈化、调制及抽吸过程中均会与烟叶中的还原糖发生梅拉德反应而形成多种重要的致香成分，故烟叶中游离氨基酸种类的多少和含量的高低会直接影响烟叶的内在品质，由于氨基酸分析在烟草化学分析领域 的研究中起着重要的作用，因此，对烟草中的氨基酸分析方法的研究与改进得到人们高度重视。所以研究烟叶中氨基酸含量的测定方法及其应用有着重要的理论和实践意义。氨基酸分析是烟草化学研究中最重要的分析技术之一。 1958年， Moore和 Stein 3-5等首先提出了用阳离子交换色谱与柱后茚三酮衍生结合的方法分析蛋白质水解生成的氨基酸，实现了氨基酸分析的自动化。其后，传统氨基酸分析随着衍生方法、柱载体化学、灵敏度和自

4、动化程度不断提高。近年来人们越来越重视氨基酸分析方法的研究与改进，柱前衍生反相高效液相色谱法、高效阴离 子交换色谱-积分脉冲安培检测法、毛细管电泳分析等相继应用于氨基酸分析，现在已是多种氨基酸分析方法并存、互补，使氨基酸分析的灵敏度、准确度、分析速度直至仪器设备的自动化程度均提高到了一个崭新的水平，形成了具有广泛适应性的现代氨基酸分析技术。 1、纸色谱和薄层色谱分析 二十世纪 40-50年代，纸色谱法分析氨基酸得到迅速发展，由于其具有操作简单、分离效能较高、所需仪器设备廉价、因而在当时得到应用广泛。纸色谱法采用不同的层析液和检测用显色剂，可以对 30多种氨基酸及其衍生物进行分析 6-12。 J

5、ean13在早 期的烟草游离氨基酸定量分析方面做了大量且详实的工作，他主要利用双向纸层色谱对烟草游离氨基酸进行分离并对其含量作了测定。薄层色谱 (Thin Layer Chromatography)常用 TLC表示，又称薄层层析，属于固 -液吸附色谱。 薄层色谱是上个世纪 60年代发展起来的分析方法。这个方法的特点是操作方便、设备简单、层析速度快、灵敏度高，广泛应用于分离和测定氨基酸，可以对多达 60多种氨基酸及其衍生物进行分离分析 14-16。薄层层析的分辨率一般比纸层析高 10-100倍，既能分离几十微克的样品，也能用于分离制备大 于 500毫克的样品。为了进行定量分析也可使用浓硫酸、浓盐

6、酸一类的腐蚀性显色剂显色，因此4 薄层色谱分析比纸色谱的应用更广泛。 随着氨基酸分析的研究日渐活跃和分析仪器快速发展，以及复杂样品对氨基酸分析的要求 灵敏度高、分析时间短和重复性好等特点 ， 纸色谱和薄层色谱分析氨基酸的应用日渐减少。 2、 气相色谱分析 二十世纪五十年代和六十年代，随着气相色谱的发展与普及，气相色谱用于氨基酸分析方面的研究开始逐渐广泛起来，由于气相色谱分析是一种高效能、选择性好、灵敏度高、操作简单、应用广泛的分析、分离方法，并且易于与质谱联用，确 定氨基酸的结构，从而有可能发现新的氨基酸，近年来，已在生化、医药、食品等方面得到广泛的研究。但是氨基酸不易汽化，气相色谱分析氨基酸

7、首先要将氨基酸转化为易于汽化的衍生物，然后选择合适的柱子和检测器进行分离测定。气相色谱 (GC)用于测定衍生的氨基酸已有较长时间 17，目前对氨基酸比较好的气相色谱衍生方法是将氨基酸衍生为 N-三氟乙酰基正丁酯 18、 19、 N-七氟丁酰基异丁酯 20、 21或特丁基二甲硅烷基衍生物 22、 23。 Husek24报道了气相色谱 (GC)测定氯甲酸乙酯衍生的氨基酸，从样品的衍生到样 品的分离测定在 5min 内即可完成。 GC/MS 也是一种强有力的氨基酸分析方法，尤其是在分析氨基酸的对映异构体有特殊的作用 25。虽然气相色谱的毛细管柱有很高的分离效能和高灵敏度，但是由于气相色谱将氨基酸衍生

8、化的条件比较苛刻、专一性差，同时由于其它分析仪器的发展，致使气相色谱在氨基酸实际分析测定的应用中普及不是很广。刘百战 1等用毛细管气相色谱法测定了 23 个品牌的国内外卷烟 中的游离氨基酸。杜启云 26等利用山梨醇作内标采用毛细管气相色谱法检测了国内外 21 种牌号卷烟的天门氨酸和脯氨酸。 Ali27采用 GC-SIM-MS 成功分析了烟草制品中氨基酸的对映异构体 L-氨基酸和 D-氨基酸。 3、高效液相色谱分析 二十世纪 80年代以来， HPLC测定氨基酸的研究日渐活跃，特别是最近二十年来柱前衍生高效液相色谱法分析氨基酸是迅速发展起来的一种分离分析技术，高效液相色谱与各种氨基酸衍生方法相结合

9、的分析技术发展迅速，并逐渐显示出特有的优越性，具有分析速度快，准确性好、灵敏度高、分析时间短、适用性极广等优点 28，为氨基酸分析提供了广阔前景。 HPLC要求将氨基酸在柱前转化为适于反相色谱分离并能被灵敏检测的衍生物。柱前衍生的关键 在于衍生试剂的选择，选择衍生试剂的标准是能与各氨基酸定量反应，每种氨基酸只生成一种化合5 物且产物有一定的稳定性，不产生或易于排除干扰物；操作简单，色谱分离分辨率高，检测灵敏度高，分析时间短，便于实现自动化和使产物能在不同型号的高效液相色谱仪上测定。目前已有大量关于氨基酸衍生方法研究方面报道，具有代表性的氨基酸分析用的柱前衍生试剂主要有邻苯二甲醛 (OPA)29

10、-33、异硫氰酸苯酯 (PITC)34-41,氯甲酸芴甲酯 (FMOC-Cl)42-47及二甲氨基萘磺酰氯 (Dansyl-Cl)48、49、 2， 4-二硝基氟苯（ DNFB） 50、 51、 6-氨基喹啉基 -N-羟基琥珀酰亚胺氨基甲酸酯（ AQC） 52-54、磺酰氯二甲胺偶氮苯（ Dabsyl-Cl） 55-57等。这些衍生试剂的主要特点见表 1： 表 1 柱前氨基酸衍生试剂的特点 氨基酸的柱前衍生 HPLC分析技术以其特有的优势 -灵敏度高、分析时间短和重复性好等，为人们越来越重视。实际工作中，具体用何种方法应根据衍生速度与简便程度、分析速度、检测二级氨基酸与胱氨酸能力、干扰因素、灵

11、敏度和重复性等指标做出选择。目前高效液相色谱法被广泛应用于 烟草样品中氨基酸含量检测。 谢复炜 58等采用一种自动柱前衍生化的高效液相色谱法 OPA，利用荧光检测器进行检测，同时测定了烟草中的十八种游离氨基酸含量，最小检测量达到150fmol。李丹 59、 60等利用 柱前衍生高效液相色谱法 系统研究了不同等级烟叶中的游离氨基酸。张鼎方 61、王蕾 62、王文领 63分别利用 柱前衍生高效液相色谱法探索卷烟加工关键工序烟草游离氨基酸的变化规律，为卷烟配方和加工工艺参数的优化提供理论依据。 4、高效阴离子交换色谱 -积分脉冲安培检测法 高效阴离子交换色谱 -积分脉冲安培检测 法 (HPAEC-I

12、PAD)是一种无需柱前衍生试剂 参数 OPA PITC FMOC-Cl Dansyl-Cl AQC DNFB Dabsyl-Cl 衍生物稳定性 不稳定 稳定 稳定 稳定 很稳定 稳定 很稳定 灵敏度（ mol） 10-15 10-12 10-15 10-12 10-15 10-12 10-12 是否与二级氨基酸反应 否 是 是 是 是 是 是 衍生操作 很简单 复杂 简单 简单 简单 复杂 简单 检测方法 荧光 紫外 紫外 /荧光 紫外 /荧光 紫外 /荧光 紫外 紫外 /荧光 是否受衍生剂干扰 否 是 是 是 是 是 是 6 和柱后衍生的氨基酸直接分析方法。此方法是基于氨基酸分子中的羧基在强

13、碱性介质中可以形成阴离子，而氨基酸分子中的氨基在强碱性介质中通过施加一定的电位，可在金电极表面发生氧化反应，从而实现氨基酸的阴离子交换色谱分离和积分脉冲安培检测。 1983年， Polta和 Johnson64首先提出了用阴离子交换色谱 -脉冲安培检测法分析氨基酸。其后， Welch等 65对脉冲安培检测氨基酸和积分脉冲安培检测氨基酸进行了比较研究，提出了检测氨基酸的积分脉冲安培检测波形。以上研究工作虽然实 现了氨基酸的直接分离检测，但由于存在基线漂移、线性、重现性差、电极损耗大以及无高效阴离子色谱柱分离氨基酸等问题，因此未能使氨基酸的分析达到可应用程度。 1999年， Clarke等 66发

14、展了一种积分脉冲安培检测氨基酸的优化波形，采用高效阴离子交换柱，成功地实现了氨基酸的高效阴离子交换色谱分离和积分脉冲安培检测，该脉冲安培检测方法具有高灵敏性和稳定性好等优点。但用积分脉冲安培法检测氨基酸时，存在金工作电极易被污染需要经常清洗的问题，为克服金电极的污染的缺点， 2003年， Cheng和 Jandik等 67研制了 “可抛弃 ”金电极，用此电极分析氨基酸，除了无须经常清洗电极之外，还保证了结果与普通金电极一致。 HPAEC-IPAD分析氨基酸不需要对氨基酸进行衍生化处理，可直接进行分离、检测，对氨基酸的检出限为 pmol级。由于糖类化合物 (含有多羟基 )在强碱性介质中可以形成阴

15、离子并可用脉冲安培法检测，因此，用 HPAEC-IPAD亦可分析糖类化合物、氨基糖和糖酸等。 梁立娜 68利用离线除糖的方法，去除烟叶和烟草料液中大量干扰糖类，建立了高效阴离子交换色谱 -积分脉冲安培法 (HPAEC-IPAD)直接检测烟叶和烟草料液中氨基酸的 方法，回收率可达 76 105。牟世芬 69发展了一种简单可靠的一次进样同时分析 17种氨基酸和一些糖类的高效阴离子交换色谱 -积分脉冲安培法，进一步拓展该法的应用。 5、毛细管电泳分析 毛细管电泳是以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术，它迅速发展于 20世纪 80年代中后期。具有高效、快速、样品用量少等优点，有许多关于毛细管电

16、泳技术 (CE)分析氨基酸的报道 70-72。两种 CE模式用于氨基酸的分析。一种是毛细管区域电泳 (CZE)，另一种是胶束电动毛细管色谱 (MECC )。与 HPLC相比， CE的优点是 分离效率高，无须梯度洗脱，分析速度快，溶剂消耗少。然而，CE分析的重现性较差。 Smith73、 74和 Poinsot 75、 76分别 综述了毛细管电泳技术 (CE)分析氨基酸的最近十年的进展，综述了 CE与紫外、荧光、电化学、质谱等检测7 技术联用分析实际样品中的氨基酸。 Carlos和 Charles 77以微芯片毛细管电泳结合脉冲安培检测器，方法无需衍生化，分离缓冲液采用 Na2B4O7(pH=9

17、.45)，在不到45s的时间内成功分离了三种氨基酸。目前，关于 CE分析氨基酸主要集中在胶束电动毛细管色谱 (MECC)，但是胶束电动毛细管色谱 (MECC )由于在流动相中使用了难挥发的表面活性剂致使其与质谱（ MS）联用存在很大问题。最近， CE-MS联用技术在氨基酸分析方面得到了越来越多关注 78-80。 Soga和 Heiger81运用CE-MS联用技术直接分析检测了氨基酸，检测结果虽然比荧光检测技术的灵敏度差，但是比紫外可见检测技术灵敏 100倍。何友昭 82等采用毛细管区域电泳与紫外联用技术以氨基苯磺酸作为背景电解质快速分析了烟叶中的氨基酸，实验结果说明此法灵敏度高、重现性好，可用

18、于烟叶中游离氨基酸的测定。 6、小 结 由于氨基酸分析在生命科学、食品科学、临床医学等领域研究中的重要作用，因此，对氨基酸分析方法的研究与改进将会继续得到人们高度重视。目前，国内外已研究过的氨基酸分析方法包括茚三酮比色法、纸色谱和薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、高效阴离子交换色谱 -积分脉冲安培检测法和毛细管电泳等方法。柱后茚三酮衍生高效阳离子交换色谱法是一种已成熟的经典氨基酸分析方法，此方法未来的发展将主要集中在仪器的柱系统及仪器的自动化方面。柱前衍生反相高效液相色谱法是研究比较多的一种氨基酸分析方法，此方法未来的发展将主要集中在选择 高稳定、高灵敏的衍生试剂，使该方法更趋灵敏、可靠

19、。无需柱前、柱后衍生的高效阴离子交换色谱 -积分脉冲安培检测法是一种新的氨基酸分析方法，此方法简单、灵敏，在氨基酸分析中将会得到越来越重要发展，新型高效阴离子交换柱和稳定、可靠的积分脉冲安培检测器的研制以及分离、检测机理的研究，将是此方法未来研究的重点。 CE今后发展方向仍是继续提高分辨率、速度和检测器的选择性，将 CE与质谱仪更好的结合，可对生物分子特性做出更快、更准确的分析，以进一步拓宽 CE在氨基酸分析领域的应用范围，此外，毛细管电泳技术将在氨基酸及其对映体分析 方面起重要作用，高效液相色谱/质谱 (HPLC/MS)和毛细管电泳 /质谱 (CE/MS)分析氨基酸将得到大的发展。 随着氨基

20、酸分析技术在其他领域的迅速发展和应用，也必将推动该技术在烟草化学领域中迅速发展和应用。目前柱前衍生反相高效液相色谱法被广泛应用于烟草和其它样品中氨基酸含量检测。随着高效阴离子交换色谱 -积分脉冲安培检8 测法，毛细管电泳方法的进一步完善，仪器的进一步发展和完善，这两种方法将在烟草中的氨基酸分析发挥越来越重要的作用。 2.标准适用范围 本标准规定了烟草 及 烟草制品中游离氨基酸测定离子色谱 -积分脉冲安 培法。 本标准适用于烟草 及 烟草制品中 精氨酸、赖氨酸、色氨酸、丙氨酸、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸、丝氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、酪氨酸

21、等 18种常见游离氨基酸的测定。 3.原理 用盐酸溶液萃取烟草或烟草制品中的游离氨基酸，萃取液经阳离子固相萃取小柱纯化，通过离子色谱 -积分脉冲安培法测定，外标法定量。 4.实验方法 4.1 仪器设备 分析天平（ METTLE TOLEDO XP205），感量 0.1mg ICS3000 多功能离子色谱仪（美国 Dionex 公司） ，配备电化学检测器 推荐色谱柱： AminoPac PA10 阴离子交换柱，包括分析柱 (250 mm2 mm)和保护柱 (50 mm2 mm) 水相滤膜： 0.22 m Milli-Q型超纯水系统（美国 Millipore 公司） 台式 ZP-200 振荡器（江

22、苏太仓实验设备厂） 3K15 离心机（德国 Sigma 公司） N-EVAP-112 氮吹仪（美国 Organomation 公司） 4.2 试剂和材料 除特殊要求外均使用优级纯试剂 水，电阻率 18.2 Mcm的超纯水 18 种氨基酸标样（ 99%, 生化试剂， Sigma 公司） 无水醋酸钠（ 99.9%, Dionex 公司） 氢氧化钠 （ 优级纯，上海国药集团 ） 28-30%氨水（ Merck 公司） 37%HCl（ Merck 公司） 9 4 mL 500 mg SCX 固相萃取小柱（ Alltech 公司） 4.3 样品前处理 称取 1.0 g 试样，精确至 0.1 mg，置于

23、100 mL 磨口锥形瓶中， 准确加入 40 mL 0.1 mol/L 盐酸萃取溶液 ， 具塞后置于振荡器振荡 30 min（转速： 150 r/min），将萃取液经滤纸 过滤，准确移取滤液 2 mL，再准确加入 8%磺基水杨酸溶液 2 mL，混合均匀，离心 30 min， 过阳离子固相萃取小柱纯化萃取溶液 。 4.4 色谱条件 流动相 A： 超纯水 流动相 B： 250 mmol/L NaOH 流动相 C： 1 mol/L NaAc 柱温： 32 流速： 0.25 mL/min 进样体积： 25 L 总分析时间： 75 min 检测器为电化学检测器： 积分安培检测电化学波形见表 1 表 1

24、检测氨基酸的积分安培检测电化学波形 时间（ s） 电位（ V） vs. pH-Ag/AgCl参 比电极 积分（开始、结束） 0.00 +0.13 0.04 +0.13 0.05 +0.33 0.21 +0.33 开始 0.22 +0.60 0.46 +0.60 0.47 +0.33 0.56 +0.33 结束 0.57 -1.67 0.58 -1.67 0.59 +0.93 0.60 +0.13 梯度洗脱步骤见表 2 10 表 2 离子色谱梯度洗脱步骤 时间 (min) A% B% C% 0.0 76 24 0 2.0 76 24 0 8.0 64 36 0 11.0 64 36 0 18.0

25、 40 20 40 21.0 44 16 40 23.0 14 16 70 42.0 14 16 70 42.1 20 80 0 44.1 20 80 0 44.2 76 24 0 75 76 24 0 4.5 标准工作曲线配制及制作 4.5.1 标准溶液配制 4.5.1.1 标准储备溶液：混合氨基酸标准储备液 (2.5 mol/mL)：称取 0.0333 g 天冬氨酸、 0.0298 g 苏氨酸、 0.0263 g 丝氨酸、 0.0368 g 谷氨酸、 0.0188 g 甘氨酸、 0.0223 g 丙氨酸、 0.0293 g 缬氨酸、 0.0601 g 胱氨酸、 0.0373 g 甲硫氨酸、

26、 0.0328 g 异亮氨酸、 0.0328 g 亮氨酸、 0.0453 g 酪氨酸、 0.0413 g 苯丙氨酸、 0.0388 g 组氨酸、0.0511 g 色氨酸、 0.0365 g 赖氨酸、 0.0436 g 精氨酸、 0.0288 g 脯氨酸的标准品，精确至 0.1 mg， 0.1 mol/L 盐酸萃取溶液溶解，转移至 100 mL 容量瓶中，定容，即配制成 2.5 mol/mL储备液。于 4 冰箱中避光保存，有效期为 1 个月。 4.5.1.2 18 种氨基酸工作溶液：将 2.5 mol/mL18 种氨基酸标准储备液用萃取溶剂逐级稀释得到浓度为 4、 20、 50、 125、 250、 2500（ nmol/mL）的工作溶液。 4.5.2 标准曲线制作 用 离子色谱 -积分脉冲安培法 测定一系列 18 种氨基酸工作溶液，得到 6 个浓度水平的 18 种氨基酸的积分峰面积，以峰面积为纵坐标 (Y)，纳摩尔每毫升（ nmol/mL）计的 18 种氨基酸的浓度为横坐标 (X)建立校正曲线。对校正数据进行线性回归分析，相关系数 R2 应不小于 0.99。测定 18 种氨基酸的浓度，计算每