核酸探针技术在食品检测中的应用.doc

1、1科目：食品生物技术导论学院：化学生物与材料科学学院专业：生物技术班级：090551学号：09055106姓名：黄菁2核酸探针技术在食品检测中的应用摘要：本文对于核酸探针技术进行了一系列的介绍，包括探针种类，标记原理，制备方法以及在食品检测中的应用及发展方向。关键词：食品检测 核酸探针 基因工程The nucleic acid probe of the application of the technique in food testing Abstract: in this paper the nucleic acid probe techniques for a series of int

2、roduction, including probe types, mark principle, the preparation methods and application in food testing and development direction. Keywords: food testing nucleic acid probe genetic engineering正文：一、现代生物技术在食品检验中应用的意义 食品检验检测对于保障食品安全、促进食品生产水平都起着及其重要的作用。长期以来获得广泛应用的物理、化学、仪器等检测方法，由于存在某些局限，已不能满足现代食品检测的需要，

3、随着生物技术的发展，人们已逐步认识到生物技术在食品检验中的重要作用及其意义。 生物技术检测方法以自身独特优势在食品检验中显示出巨大的应用潜力，其应用几乎涉及到了食品检验的各个方面，包括食品的品质评价、质量监督、生产过程的质量监控及食品科学研究。 生物技术检测方法不仅具有特异的生物识别功能、极高的选择性，而且它可与现代的物理化学方法相结合，产生一些简单、结果精确、灵敏、专一、微量和快速、成本低廉的检测方法，因此其在食品检验中占有越来越重要的地位。二、核酸探针技术化学及生物学意义上的探针(probe)，是指与特定的靶分子发生特异性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子。抗体-抗原、生物素-抗生物素蛋

4、白、生长因子-受体的相互作用都可以看作是探针与靶分子的相互作用。3核酸探针技术原理是碱基配对。互补的两条核酸单链通过退火形成双链，这一过程称为核酸杂交。核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。每一种病原体都具有独特的核酸片段，通过分离和标记这些片段就可制备出探针，用于疾病的诊断等研究。(一) 核酸探针的种类1.按来源及性质划分可将核酸探针分为基因组 DNA 探针、cDNA 探针、RNA 探针和人工合成的寡核苷酸探针等几类。作为诊断试剂，较常使用的是基因组 DNA 探针和 cDNA 探针。其中，前者应用最为广

5、泛，它的制备可通过酶切或聚合酶链反应(PCR)从基因组中获得特异的 DNA 后将其克隆到质粒或噬菌体载体中，随着质粒的复制或噬菌体的增殖而获得大量高纯度的 DNA 探针。将 RNA 进行反转录，所获得的产物即为 cDNA。cDNA 探针适用于 RNA 病毒的检测。cDNA 探针序列也可克隆到质粒或噬菌体中，以便大量制备。将信息 RNA(mRNA)标记也可作为核酸分子杂交的探针。但由于来源极不方便且 RNA 极易被环境中大量存在的核酸酶所降解，操作不便，因此应用较少。用人工合成的寡聚核苷酸片段做为核酸杂交探针应用十分广泛，可根据需要随心所欲合成相应的序列，可合成仅有几十个 bp 的探针序列，对于

6、检测点突变和小段碱基的缺失或插入尤为适用。2.按标记物划分有放射性标记探针和非放射性标记探针两大类。放射性标记探针用放射性同位素做为标记物。放射性同位素是最早使用，也是目前应用最广泛的探针标记物。常用的同位素有 32P、3H、35S。其中，以 32P 应用最普遍。放射性标记的优点是灵敏度高，可以检测到 Pg 级；缺点是易造成放射性污染，同位素半衰期短、不稳定、成本高等。因此，放射性标记的探针不能实现商品化。目前，许多实验室都致力于发展非放射性标记的探针。目前应用较多的非放射性标记物是生物素(Biotin)和地高辛(digoxigenin)。二者都是半抗原。生物素是一种小分子水溶性维生素，对亲和

7、素有独特的亲和力，两者能形成稳定的复合物，通过连接在亲和素或抗生物素蛋白上的显色物4质(如酶、荧光素等)进行检测。地高辛是一种类固醇半抗原分子，可利用其抗体进行免疫检测，原理类似于生物素的检测。地高辛标记核酸探针的检测灵敏度可与放射性同位素标记的相当，而特异性优于生物素标记，其应用日趋广泛。(二) 核酸探针的标记1.放射性同位素标记法 常将放射性同位素如 32 P 连接到某种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)上做为标记物，然后通过切口平移法标记探针。切 口 平 移 法 (nick translation) 是 利 用 大 肠 杆 菌 DNA 聚 合 酶 I (E.coli DNApolymeras

8、e I) 的多种酶促活性将标记的 dNTP 掺入到新形成的 DNA 链中去，形成均匀标记的高比活 DNA 探针。2.非放射性标记法可将生物素、地高辛连接在 dNTP 上，然后象放射性标记一样用酶促聚合法掺入到核酸链中制备标记探针。也可让生物素、地高辛等直接与核酸进行化学反应而连接上核酸链。其中，生物素的光化学标记法较为常用。其原理是利用能被可见光激活的生物素衍生物-光敏生物素(photobiotin)，光敏生物素与核酸探针混合后，在强的可见光照射下，可与核酸共价相连，形成生物素标记的核酸探针。可适用于单、双链 DNA 及 RNA 的标记，探针可在-20下保 8-10 个月以上。除上述标记法外，

9、探针的制备和标记还可通过 PCR 反应直接完成。(三) 核酸杂交杂交技术有固相杂交和液相杂交之分。固相杂交技术目前较为常用，先将待测核酸结合到一定的固相支持物上，再与液相中的标记探针进行杂交。固相支持物常用硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称 NC 膜)或尼龙膜(nylon membrane)。固相杂交包括膜上印迹杂交和原位杂交。前者包括三个基本过程：第一，通过印迹技术将核酸片段转移到固相支持物上；第二，用标记探针与支持物上的核酸片5段进行杂交；第三，杂交信号的检测。用探针对细胞或组织切片中的核酸杂交并进行检测的方法称之为核酸原位杂交。某特点是靶分子

10、固定在细胞中，细胞固定在载玻片上，以固定的细胞代替纯化的核酸，然后将载玻片浸入溶有探针的溶液里，探针进入组织细胞与靶分子杂交，而靶分子仍固定在细胞内。例如。可用特异性的细菌、病毒的核酸做为探针对组织、细胞进行原位杂交，以确定有无该病原体的感染等。原位杂交不需从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，在临床应用上有独特的意义。近年来液相杂交技术有所发展。液相杂交与固相杂交的主要区别是不用纯化或固定的靶分子，探针与靶序列直接在溶液里作用。液相杂交步骤有所简化，杂交速度有所提高，增加了特异性和敏感性，但与临床诊断所要求的特异性和敏感性还有一定的距离。各种杂交技术中，膜上印迹杂交技术

11、应用最为广泛，它由以下三个基本过程组成。1.核酸印迹技术(1) 斑点印迹(Dot-blot)将待测核酸样品变性后直接点样在膜上，称之为斑点印迹。(2) Southern 印迹(Southern blot)转移到固相支持物上的过程。Southern 印迹的操作方法有三种： 毛细管转移(或虹吸印迹)。 电转移。利用电场的电泳作用将凝胶中的 DNA 转移到固相支持物上，可达到简单、迅速、高效的目的。 真空印迹法这是近年来发展起来的一种简单、快速、高效的 DNA 和 RNA 印迹法。其基本原理是利用真空作用将转膜缓冲液从凝胶上层的容器抽到下层，凝胶中的核酸片段将随缓冲液移置到凝胶下面的固相支持物上。S

12、outhern 印迹后的滤膜仍需进行固定处理，对 NC 膜可用 80真空烘烤 2 小时，对尼龙膜还可用短波紫外线(波长 254nm)照射几分钟。6(3) Northern 印迹(Northern blot)Northern 印迹是指将 RNA 片段变性及电泳分离后，转移到固相支持物上的过程。RNA 样品经 Northern 印迹后进行杂交反应可鉴定其中特异 mRNA 分子的量与大小。2.杂交反应的基本过程杂交反应包括预杂交、杂交和漂洗几步操作。预杂交的目的是用非特异性 DNA 分子(鲑精 DNA 或小牛胸腺 DNA)及其它高分子化合物(Denharts 溶液)将待测核酸分子中的非特异性位点封闭

13、，以避免这些位点与探针的非特异性结合。杂交反应是使单链核酸探针与固定在膜上的待测核酸单链在一定温度和条件下进行复性反应的过程。杂交反应结束后，应进行洗膜处理以洗去非特异性杂交以及未杂交的标记探针，以避免干扰特异性杂交信号的检测。膜洗净后,将继续进行杂交信号的检测。3 杂交信号的检测当探针是放射性标记时，杂交信号的检测通过放射自显影进行。即利用放射线在 X 光片上的成影作用来检测杂交信号。操作时，在暗室内将滤膜与增感屏、X 光片依序放置暗盒中，再将暗盒置-70曝光适当时间，取出 X 光片，进行显影和定影处理。对于非放射性标记的探针，则需将非放射性标记物与检测系统偶联，再经检测系统的显色反应来检测

14、杂交信号。以地高辛的碱性磷酸酶检测反应为例，地高辛 (Dig)是一种半抗原，杂交反应结束后，可加入碱性磷酸酶标记的抗 Dig 抗体，使之在膜上的杂交位点形成酶标抗体 Dig 复合物，再加入酶底物如氮蓝四唑盐 (NBT)和 5-溴-4-氯-3-吲哚酚磷酸甲苯胺盐(BCIP)，在酶促作用下，底物开始显蓝紫色。其基本反应程序类似 ELISA，杂交信号的强弱，通过底物显色程度的深浅、有无来确定。三、在食品检测中的应用一、以 DNA为靶目标的检验中国开展的食品微生物检验项目主要包括细菌总数、 大肠菌群、 沙门菌、霉菌和酵母以及毒素等。所以， 有关的检测有很多是针对细菌而来的DNA 是细菌的主要遗传物质，

15、 所以设计的探针一般是目标DNA的互补序列。在设计探7针时要依照待检测微生物特异的DNA序列。比如在设计检测产气荚膜梭菌的探针时， 克隆的是产气荚膜梭菌的产毒基因。致肠病的大肠杆菌则针对其致肠病的基因序列来设计。这种检验在食品微生物检测中的应用研究十分活跃， 例如：如食品中的大肠杆菌、沙门菌、志贺菌、小肠结肠炎耶尔森、产单核细胞李斯特菌、金黄色葡萄球菌的检测等二、以rRNA为靶目标的检验该种检验方法常使用AccuProbe基因作为探针， 其原理是利用Acridinium ester作为荧光发光物质， 标记特异性单链作为探针， 与待测细菌中的核糖体RNA互补， 形成稳定的DNA,RNA杂交体。选

16、择试剂再将未结合的多余探针破坏掉，最后通过发光仪检测标记的杂交体。翁文川等应用该方法检测食品中产单核细胞李斯特菌， 结果表明， 采用该基因探针方法检测食品中产单核细胞李斯特菌特异性强， 需要的时间短。吴仲梁等也用AccuProbe检测食品中的产单核细胞李斯特菌， 同样证明该方法具有正确、 灵敏、 快速、 简便等优点， 适于推广应用。三、核酸杂交技术应用于食品微生物检验的优点、 问题和展望利用核酸杂交技术进行食品微生物检验比传统方法更加准确、 灵敏， 但同时也增加了假阳性出现的机会。所以在实验过程中， 一定要保证实验环境的干净， 避免其它DNA造成的污染。将来， 核酸杂交技术会越来越多地和其它技

17、术手段相结合， 应用于食品微生物的检验中；DNA芯片也会随着其成本的降低而被推广应用。 核酸探针技术已被广泛应用于进出口动植物及其产品的检验。用于检验食品中一些常见的致病菌及产毒素菌，如大肠杆菌、沙门氏菌等多种病原体的检验。近年来，放射性同位素标记的核酸探针正越来越多地用于产肠毒素性大肠杆菌的快速检测。参考文献：1.Robert FW Molecular Biology 20022.宁红.秦蓁 分子生物学技术在检疫性有害生物诊断中的应用期刊论文-植物8检疫 2002(02)3.李志勇.胡小云.凌莉 国内外的食品微生物检验期刊论文-检验检疫科学 2004(06)4.王平.孙晓苏.刘汉芬 应用 DNA 探针技术快速检测食品中产气荚膜梭菌产肠毒素基因的研究期刊论文-中国预防医学杂志 2001(03)5.徐茂军 基因探针技术及其在食品卫生检测中的应用期刊论文-食品与发酵工业 2000(12)6.翁文川.李志勇.胡科锋 基因探针快速检测食品中单增李斯特氏菌期刊论文-食品科技 2003(01)7.吴仲梁.李晓虹.韩伟 利用商品 DNA 探针对食品中单核细胞增生李斯特菌的快速检测评估期刊论文-中国人兽共患病杂志 2002(05)