HPLC法测定醋酸奥曲肽的聚合物.DOC

1、HPLC 法测定醋酸奥曲肽的聚合物 初虹 盛伟红 徐龙芳 马青铁 （苏州中科天马肽工程中心有限公司 苏州 215101） 摘要 目的 ；建立 HPLC 法测定醋酸奥曲肽的聚合物。 方法 ：采用 凝胶色谱柱（ TSK GEL 2000SWXL 7.8mm300mm,5m），以三氟乙酸 -乙腈水（ 0.032： 20： 80）为流动相，流速为 0.7ml/min，检测波长为 210nm。 结果 ： 理论塔板数高，峰形好， 系统适应性符合规定，分子量标准曲线线性回归的相关系数为 0.995， 结论 ：本方法准确、快速、简捷。 关键词 ： HPLC 法 醋酸奥曲肽 聚合物 Determination

2、of the Polymer of Octreotide Acetate By HPLC CHU Hong,SHENG Wei-hong,XU Long-fang,MA Qing-tie (ChinaTech Peptide CO.， Ltd. SUZHOU 215101) Abstract Objective:To establish HPLC method for determination of the polymer of octreotide acetate . Methods:using gelatin chromatographic column(TSK GEL 2000SWXL

3、 7.8mm300mm,5m),mobile phase was Trifluoroacetic acid-acetonitrile-water(0.032:20:80),The flow rate was 0.7ml/min The wavelength used for detection was 210nm.Results: The theoretical plate number is high,the peak shape is good,the system suitability Complies to the prescription,the correlation coeff

4、icient of standard curve is 0.995. Conclusion:The method is rapid,simple and accurate. Key words HPLC Octreotide Acetate Polymer 醋酸奥 曲肽（ octreotide acetate）是一个以生长抑素活性片段为骨架人工合成的长效生长激素释放抑制素，可选择性的直接作用于血管平滑肌，使内脏循环血量降低 25% 35%，门脉血流量和门静脉压力下降，还能抑制胃酸和胃蛋白酶的分泌，从而防止血凝块破坏而再出血 1，临床主要用于治疗肝硬化并发食管胃底静脉曲张破裂出血，其止血率为 8

5、0%90%2。 有 HPLC 法测定醋酸奥曲肽含量和有关物质 3的报道，但未见醋酸奥曲肽聚合物测定的报道。 本文采用 HPLC 法测定醋酸奥曲肽的聚合物，方法 准确、快速、简捷。 一、仪器 和试剂 1、 仪器： Agilent 1200 高效液相色谱仪系 统 (含一台 G1322A 脱气机、 G1311A 四元泵、 G1329 自动进样器、 G1316A 柱温箱、 G1314B 紫外检测器和一套Agilent 1200 CHEMSTATION 软件 )。 2、 药品； 醋酸奥曲肽（由中国药品生物制品检定所提供，批号为 140730-200601）； 胸腺肽 1 （由中 国 药 品 生 物 制

6、品 检 定 所 提 供 ， 批 号 为140655-200301）；生长抑素（由中国药品生物制品检定所提供，批号为 140656-200301）；醋酸奥曲肽 原料（ P20070701、 P20070702、 P20070703）由苏州天马医药集团天吉生物制药有限公司提供。 3、 试剂：乙腈（色谱纯，德国默克公司），三氟乙酸（色谱纯，德国默克公司），水（超纯水） 。 二、方法与结果 1 、 色谱条件 用 凝 胶 色谱 柱 （ TSK GEL 2000SWXL 7.8mm300mm,5m）；以三氟乙酸 -乙腈水（ 0.032： 20： 80）为流动相；流速为 0.7ml/min；检测波长为 21

7、0nm；进样量 为 20l。 2、 系统适用性试验 用凝胶色谱柱（ TSK GEL 2000SWXL 7.8mm300mm,5m）；以三氟乙酸 -乙腈水（ 0.032： 20： 80）为流动相； 胸腺肽 1（分子量3108）、生长抑素（分子量 1638）、奥曲肽（分子量1019），加水制成每 1ml中含 0.1mg的溶液作为分子量标准溶液。将上述三种溶液等量混合，作为分子量标准溶液混样，取分子量标准溶液混样溶液 20l注入 液相 色谱仪，记录色谱图，计算理论 塔 板数和分离度 ，结果见表 1。 表 1 系统适应性试验 结果 名称 保留时间 分离度 理论塔板数 胸腺肽 1 13.819 9714

8、 生长抑素 15.343 3.17 23539 奥曲肽 16.105 1.92 27039 图 1 系统适应性 HPLC 图谱 结论：在上述色谱条件下， 理论塔板数符合要求，分离度良好， 符合系统适 应 性 试验 要求 ， 色谱峰形好，说明该流动相适合本品聚合物的测定。 3、 标准曲线的制备 分别取胸腺肽 1（分子量3108）、生长抑素（分子量 1638）、奥曲肽（分子量1019）适量，加水制成每 1ml 中含 0.1mg 的溶液作为分子量标准溶液。 分别取 分子量标准溶液 20 l 注入色谱仪，记录色谱图，重复进样 6 次，以各峰 保留时间 的平均值 为横坐标，分子量对数为纵坐标作标准 曲线

9、 ， 进 行 线 性 回 归 ， 求 得 回 归 方 程 为LogM=-0.2047t+6.3194（ M 为分子量， t 为峰的保留时间） ， r=0.995。 结果表明 ：在上述色谱条件下， 分子量标准溶液重复进样保留时间相对偏差均小于 2.0，其标准曲线线性关系良好。 4、 溶液稳定性 取 P20070701 批样品约 12.5mg，精密称定，置 100ml 量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液； 分别于 0、 0.5、 1、 1.5、 2、2.5、 3、 4、 8 小时，取 供试品溶液 20l注入液相色谱仪，同时做 1 对照溶液，按自身对照法 以峰面积 计算杂质含量 ，即

10、得。 聚合物检查结果一致 ， 表明， 以水做溶剂，样品溶液稳定性好，故选水为溶剂溶解样品 。 5、 线性 精密称取 醋酸奥曲肽对照品 约 12.5mg，精密称定，置 100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，分别取 0.1ml、 0.2ml、 0.5ml、 1ml、 2ml、 4ml置 100ml量瓶中，加水至刻度，混匀，得到一系列溶液， 注入高效液相色谱仪 ，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，求得回归方程为。A = 64.343C + 2.9704（ A为峰面积， C为溶液浓度，单位为 ug/ml） ， r=0.99996。 结果表明，醋酸奥曲肽在浓度为 0.125ug/ml到

11、 5.00ug/ml的范围内，峰面积与浓度的线性关系良好。 6、 检测限 当信噪比约为 3:1 时即为检测限，结果表明醋酸奥曲肽聚合物测定的检测限 0.087 ug/ml。 7、 样品聚合物测定 取本品约 12.5mg，精密称定，置 100ml 量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液； 精密量取 1ml，置 100ml 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。精密量取供试品溶液和对照溶液各 20l注入 液相 色谱仪，按上述条件进行测定，供试品溶液的色谱图主峰之前如 有杂质峰，按自身对照法 以峰面积 计算杂质含量， 结果见表 2。 表 2 样品聚合物检查结果 批号 聚合物（） P

12、20070701 0.20% P20070702 0.18% P20070703 0.21% 图 2 样品聚合物测定 HPLC 图 三、讨论 1、凝胶色谱法又叫分子排阻色谱 法，分子量大的物质先被洗脱，分子量小的物质后出峰，奥曲肽主峰之前的峰的分子量大于奥曲肽的分子量，故都作为奥曲肽的聚合物计算。 2、 所建立的 HPLC 法 准确、快速、简捷。 醋酸奥曲肽在浓度为 0.125ug/ml到 5.00ug/ml的范围内，峰面积与浓度的线性关系良好。 醋酸奥曲肽聚合物测定时醋酸奥曲肽的检测限 0.087 ug/ml。可有效测定奥曲肽中的聚合物。 参考文献 1 WANG Ya-dong( 王 亚 东

13、 ),ZHU Jia-yi( 蛛家沂 ),SHEN Hong-zhang( 沈洪章 ),et al. Treatment effect of bleeding esophageal varices by somatostatian(生长抑素治疗食道静脉曲张破裂大出血效果观察 ). Chin J Dig Endosc(中华消化内镜杂志 ),1998,15(4):235(in Chinese) 2 YANG Ning(杨宁 )， XU Hong-bo(许红波 )， Clinical study of somatostatian analog octreotide(生长抑制类似物奥曲肽的临床 )，

14、New Drugs Clin Rem(新药与临床 ),1997,13(1):31(in Chinese) 3 WU Qiong-zhu( 吴琼珠 ) ， DAI Yong-jian( 戴永健 ),LIU Wei-wei(刘卫卫 ),QIAO Shan-lei(乔善磊 ),Determination of the Content of Octreotide and its Related substances by HPLC(HPLC法测定奥曲肽的含量及其有关物质 ). Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis( 药 物 分 析 杂 志 ).2002,22(4):301(in Chinese)