分子生物学总结.doc

1、问答题：1 衰老与基因的结构与功能的变化有关，涉及到：（1）生长停滞；（2）端粒缩短现象；（3）DNA 损伤的累积与修复能力减退；（4）基因调控能力减退。2 超螺旋的生物学意义：（1）超螺旋的 DNA 比松驰型 DNA 更紧密，使 DNA 分子体积变得更小，对其在细胞的包装过程更为有利；（2）超螺旋能影响双螺旋的解链程序，因而影响 DNA 分子与其它分子（如酶、蛋白质）之间的相互作用。3 原核与真核生物学 mRNA 的区别：原核：（1）往往是多顺反子的，即每分子 mRNA 带有几种蛋白质的遗传信息（来自几个结构基因） 。 （2）5 端无帽子结构，3 端一般无多聚 A 尾巴。 （3）一般没有修饰

2、碱基，即这类 mRNA 分子链完全不被修饰。真核：（1）5 端有帽子结构（2）3 端绝大多数均带有多聚腺苷酸尾巴，其长度为 20-200 个腺苷酸。 （3）分子中可能有修饰碱基，主要有甲基化， （4）分子中有编码区与非编码区。4 tRNA 的共同特征：（！）单链小分子，含 73-93 个核苷酸。 （2）含有很多稀有碱基或修饰碱基。 （3）5 端总是磷酸化，5 末端核苷酸往往是 pG。 （4）3 端是 CPCPAOH 序列。 （5）分子中约半数的碱基通过链内碱基配对互相结合，开成双螺旋，从而构成其二级结构，开头类似三叶草。 （6）三级结构是倒 L 型。5 核酶分类：（1）异体催化的剪切型，如 R

3、NaseP；（2）自体催化的剪切型，如植物类病毒等；（3）内含子的自我剪接型，如四膜虫大核 26SrRNA 前体。6 hnRNA 变成有活性的成熟的 mRNA 的加工过程：（1）5 端加帽；（2）3 端加尾（3）内含子的切除和外显子的拼接；（4）分子内部的甲基化修饰作用， （5）核苷酸序列的编辑作用。7 反义 RNA 及其功能：碱基序列正好 与有意义 mRNA 互补的 RNA 称为反意义或反义 RNA，又称调节 RNA，这类 RNA 是单链 RNA，可与 mRNA 配对结合形成双链，最终抑制 mRNA 作为模板进行翻译。这是其主要调控功能，还可作为 DNA 复制的抑制因子，与引物 RNA 互补

4、结合抑制 DNA 的复制，以及在转录水平上与 mRNA5 末端互补，阻止 RNA 合成转录。8 病毒基因组分型：（1）双链 DNA（2）单链正股 DNA（3）双链 RNA（4）单链负股 RNA（5）单链正股 RNA9 病毒基因组结构与功能的特点：（1）不同病毒基因组大小相差较大；（2）不同病毒的基因组可以是不同结构的核酸。 （3）病毒基因组有连续的也有不连续的；（4）病毒基因组的编码序列大于 90%；（5）单倍体基因组， （6）基因有连续的和间断的， （7）相关基因丛集；（8）基因重叠（9）病毒基因组含有不规则结构基因，主要类型有：a 几个结构基因的编码区无间隔；bmRNA 没有 5 端的帽结

5、构；c 结构基因本身没有翻译起始序列。10 原核生物基因组的结构的功能特点：（1）基因组通常仅由一条环状双链 DNA 分子组成。（2）基因组中只有 1 个复制起点。（3）具有操纵子结构。 （4）编码顺序一般不会重叠。 （5）基因是连续的，无内含子，因此转录后不需要剪切。 （6）编码区在基因组中所占的比例（约占 50%）远远大于真核基因组，但又远远小于病毒基因组。 （7）基因组中重复序列很少（8）具有编码同工酶的基因。 （9）细菌基因组中存在着可移动的 DNA 序列，包括插入序列和转座子。（10）在 DNA 分子中具有多种功能的识别区域。11 真核生物基因组结构与功能的特点：（1）每一种真核生物

6、都有一定的染色体数目，除了配子为单倍体外，体细胞一般为双倍体。 （2）真核基因组远远大于原核生物的基因组，结构复杂，基因数庞大。 （3）都由一个结构基因与相关的调控区组成，转录产物为单顺反子。（4）含有大量重复顺序。 （5）基因组内非编码的顺序占 90%以上。 （6）真核基因是断裂基因， （7）功能相关的基因构成各种基因家族，它们可串联在一起，亦可相距很远，但即使串联在一起的成簇的基因也是分别转录的。 （8）真核生物基因组中也存在一些可移动的遗传因素，这些 DNA 顺序并无明显生物学功能，似乎为自己的目的而组织，故有自私 DNA 之称。12 根据同源性程度，主要分五种类型：（1）核酸序列相同，

7、实际上是多拷贝基因；（2）核酸序列高度同源，如人类生长激素基因家族；（3）编码产物具有同源功能区；（4）编码产物具有小段保守基序；（5）基因超家族。13 DNA 复制的基本过程：（ 1）DNA 双链解开；（2）RNA 引物的合成；（3）DNA 链的延长；（4）切除引物、填补缺口、连接相邻 DNA 片段；（5）切除和修复错配碱基。14 D的损伤方式：（）转换：由一种嘧啶变成另一种嘧啶，或种嘌呤变成另一种嘌呤；（）颠换：嘧呤与嘌呤互换。转换和颠换只引起局部的改变，而其它部分的结构不受影响，故称为点突变。 （）丢失或插入一个或一段核苷酸，可能使下游的编码发生改变，此称为移码突变（）链内或链间发生共价

8、连结。 损伤的修复：（）光修复（）切除修复（）重组修复（）修复 切除修复的机制：通过一种特殊的内切核酸酶将分子中的损伤部分切除，同时以另一条完整的链为模板，由聚合酶催化填补被切除部分的空隙，再由连接酶封口，使恢复正常的结构。 大肠杆菌的一种需糖基化酶的切除修复过程：（）糖基化酶识别受损的或错误的碱基，水解糖苷键，释出游离碱基，在单链上形成无嘌呤或嘧啶的空位，称为部位；（）特异的内切核酸酶在部位切开磷酸二酯键，再由外切核酸酶切下部位的核苷酸；（）聚合酶修补缺口；（）连接酶封口，完成修复过程。逆转录酶功能：（）具有指导的聚合酶活性，能和其它聚合酶一样沿方向合成，并需要引物提供；（）具有酶活性，能特

9、异性水解杂交体上的；（）具有指导的聚合酶活性，以逆转录合成的单链为模板合成互补链。 遗传密码的特点：（）起始密码子和终止密码子；（）方向性：；（）连续性（）简并性；（）通用性（）摆动性。 常见的摆动现象（）反密码子的第一位常出现稀有碱基次黄嘌呤，它可以与密码子的第三位的、或配对；（）反密码子中的可以与密码子中的或配对；（）反密码子中的可以与密码子中的 C、G 或 U 配对。21 核糖体在蛋白质生物合成中的作用：（1）容纳 mRNA 的通道， （2）能够结合起始因子，延长因子及终止因子等参与蛋白质生物合成的因子；（3）具有结合氨酰-tRNA 的部位（A 位或 P 位） ；（4）具有转达肽酶活性，

10、催化肽键形成；（5）大亚基上具有延长因子依赖的 GTP 酶活性，它可能为肽提供能量。22 严谨反应机制：在氨基酸缺乏时，游离核糖体与空载的 tRNA 增加，在 ATP 存在下，产生 pppGpp（鸟苷-5- 磷酸）和 ppGpp(鸟苷 -4-磷酸)。后者与 RNA 聚合酶形成 ppGpp-RNA 聚合酶复合物，进而使 RNA 聚合酶构象改变，活性降低，rRNA 和 rRNA 合成减少或停止。22 葡萄糖效应及机制：细菌通常优先以葡萄糖作为能源，当培养环境中有葡萄糖时，即使加入乳糖、阿拉伯糖等其它糖，细菌也不利用这些糖，不产生代谢这些糖的酶，直到葡萄糖消耗完毕，代谢其它糖的酶才会根据相应的糖是否

11、存在而被诱导产生，这种现象称为这是由于葡萄糖代谢产物能抑制细胞腺苷酸环化酶和激活磷酸二酯酶的活性，结果使细胞人 cAMP 水平降低。当葡萄糖耗尽时，细胞内 cAMP 水平升高，即可通过 CAP 调控其它操纵子的表达。23 真核生物基因表达在 DNA 水平的调控方式：（1）染色质丢失（2）基因扩增（3）基因重排（4）DNA 甲基化（5）染色质结构对基因表达的调控作用。24 反式因子的主要特点：（1）一般具有三个功能结构域：DNA 识别结合域、转录活性域、结合其它蛋白的结合域。这些功能区含有几十到几百个氨基酸残基（2）能识别并结合上游调控区中的顺式作用元件。 （3）对基因表达有正性和负性调控作用，

12、即渡海和阻遏基因的表达。25 反式作用因子的激活方式及作用方式：激活方式（1）表达式调节；（2）共价修饰；（3）配体结合（4）蛋白质与蛋白质相互作用。作用方式（1）成环（2）扭曲（3）滑动（4）Oozing。26 mRNA 的选择剪接方式：（1）外显子选择（2）内含子选择（3）互斥外显子（4）内部剪接位点。27 细胞通讯方式：（1）细胞间隙连接（2）膜表面分子接触通讯（3）化学信号通讯。28 受体发挥其识别和信号转换作用时特点 ：（1）高度特异性（2）高亲和力（3）可饱合性（4）可逆性。29MAPK 作为细胞内的的关键信号转导分子，如何发挥作用：MAPK 由其上游分子 MAPKK 和 MAPK

13、KK 通过逐级磷酸化反应而激活。细胞受到生长因子或其它因素刺激后，MAPKK 可将 AMPK 的一个 Thr 磷酸化，从而使 MAPK 转变为有活性状态。具体表现为各自的逐级磷酸化，MAPK被激活以后，可转移至细胞核内。在核内，它可使一些转录因子发生磷酸化，从而改变细胞内基因表达的状态。另外，它也可以使一些其它的酶发生磷酸化使之活性发生改变。30 细胞转导信号的基本路线和方式可以表示为：小分子信使浓度或分布变化外源信号受体大分子信使 化学修饰 效应分子构象变化细胞应答反应蛋白质相互作用31G 蛋白偶联受体的信号传递的基本过程包括：（1） 配体与受体结合；（2）受体激活 G 蛋白（3）G 蛋白激

14、活或抑抑细胞中的效应分子；（4）效应分子改变细胞内小分子信使的含量与分布；（5）细胞内小分子信使作用于相应的靶分子，使之构象改变，从而改变细胞的代谢过程及基因表达等功能。32 G 蛋白的循环或活化过程：当物理或化学信号刺激受体时，受体活化，与 G 蛋白结合并使之发生构象改变。A 亚基与 GDP 的亲和力下降，结合的 GDP 为 GTP 所取代。A 亚基结合了 GTP 后即与 BR 亚基发生解离，成为活化状态的 A 亚基。活化了的 A 亚基此时可以作用于下游的各种效应分子。这种活化状态将一直持续到 GTP 被 A 亚基自身具有的 GTP 酶水解为 GDP。33 小分子细胞内信使一般具有的三个特点

15、：（1）不位于能量代谢途径的中心；（2）在细胞中的浓度或分布可以迅速地改变；（3）作为变构效应剂作用于相应的靶分子，已知的靶分子主要为各种蛋白激酶。34 表皮生长因子受体（EGFR ）介导的信号转导途径EGFRRasMAPK（1） 受体二聚体的形成及其磷酸化；（2）募集接头蛋白 Grb2：（3）调控分子 SOS 的活化（4）低分子量 G 蛋白Ras 的活化；（5）MAPK 的级联激活；（6）转录因子的磷酸化及其转录调控作用。35 r干扰素受体介导的细胞转导途径：r-干扰素与受体结合以后。也可以导致受体二聚体化，二聚体化的 体可以激活 JAL-STAT 系统，后者将干扰素刺激信号传入核内。JAK

16、 为一种存在于胞浆中的蛋白酪氨酸激酶，它活化后可使干扰素受体磷酸化。STAT 可以通过其 SH2 结构域识别磷酸化的受体并与之结合，然后 STAT 分子亦发生酪氨酸的磷酸化，酪氨酸磷酸化的 STAT 形成二聚体并进入胞核。二聚体 STAT 分子作为有活性的转录因子，影响相关基因的表达，进而改变靶细胞的增殖与分化。36 Klenow 片段的用途：（1 ）补齐双链 DNA 的 3 末端；（ 2）通过补齐 3 端使 3 末端标记；（3）在 cDNA 克隆中，第二股链的合成。 （4）DNA 序列分析。37 几种常见修饰酶：（1）DNA 聚合酶 I：这个酶除有聚合酶活性外，尚有 3-5 及 5-3 核酸

17、外切酶活性。由于它具有 5-3 核酸外切酶活性，当用缺口平移法标记 DNA 探针时，常用 DNA 聚合酶 I。（2）逆转录酶：逆转录酶以 RNA 为模板合成 DAN，合成时需要 4 种脱氧核苷酸及引物，合成方向为 5-3 延伸，无3-5 外切酶活性。广泛用于 mRNA 为模板合成 cDNA，构建 cDNA 文库。（3）T4DNA 连接酶：催化双链 DNA 一端 3-OH 与另一双链 DNA 的 5 端磷酸根形成 3、5- 磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平端的 DNA 末端连接起来。（4）碱性磷酸酶：去除 DNA 或 RNA 5 端的磷酸根，制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身连接，

18、提高重组效率。（5）末端脱氧核苷酰转移酶：（TdT）：将脱氧核苷酸加到 DNA 的 3-OH 上，主要用于探针标记；或者在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接。（6）TaqDNA 聚合酶和其它耐热 DNA 聚合酶。38 作为克隆载体的质粒具备以下特点：（1）分子量相对较小，能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数。 （2）具有一个以上的遗传标志，便于对宿主细胞进行选择， （3）具有多个限制酶的单一切点，称为多克隆位点（MCS ） 。39 粘性质粒的特点：（1）含有质粒的抗药性标记（2）带有入噬菌体的粘性末端（cos 区） ；（3）具有一个或多个限制酶的酶切位点；（4）其本身分子量小，容纳

19、 40kb 左右的 DNA 片段；（5）由于非重组粘性质粒很小，不能在体外包装，因而体外包装的主要是重组体，有利于以后的筛选。40 M31 噬菌体的优点：（1）噬菌体颗粒中所含有的是单链 DNA，该单链 DNA 可作为模板用于 DNA 序列分析；（2）利用单链 M13 克隆可制备成单链 DNA 探针用于杂交分析，检测 DNA 或 RNA，或者作为基因定点诱变的载体。41 大肠杆菌与哺乳动物表达载体的不同：大肠杆菌：含有复制位点、抗性基因、克隆位点，可导入大肠杆菌，与克隆载体一样，表达载体中含有表达系统元件，即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。哺乳动物：真核表达载体中含有一套真核表

20、达元件：；启动子/增强子-克隆位点-终止信号和加 poly(A)信号。42 重组 DNA 的目的和基本过程：目的：（1）克隆某个特定的基因；（2）建立基因文库、cDNA 文库， （3）将特定的基因片段进行亚克隆以进行 DNA序列测定；（4）构建表达载体以便在特定的宿主细胞中表达某个基因。过程：（1）制备目的基因和相关载体（2）将目的基因和有关载体进行连接（3）将重组的 DNA 导入受体细胞（4）DNA 重组体的筛选和鉴定（5）DNA 重组体的扩增、表达和其它研究。43 c的合成过程：先从细胞中提取高质量的 m。因 mA 有 poly(A)尾巴，可用 1218 寡聚 d(T)片段作为引物，加入

21、4 种 dNTP,AMV(或 MMLV)逆转录酶催化第一股链的合成。然后用 RNaseH 去掉 mRNA，剩下的单链 DNA的 3 端往往有自发回折（原因不明）形成的发夹结构，正好可以作为合成第二条 DNA 链的引物；由 T4DNA 聚合酶催化第二股链的合成，即得到双链 cDNA 的混合体，采用 S1 核酸酶处理，可得到平端的双链 cDNA。44 目的基因的筛选与鉴定：首先筛选出转化菌；然后筛选出带有重组体的克隆；最后是对 DNA 重组体进行鉴定。方法：遗传学方法（插入灭活法、a-互补） ；免疫学方法；核酸杂交法；PCR 技术；酶切鉴定。45 真核细胞转染的基本方法：（1）磷酸钙共沉淀法（2）

22、电穿孔法（3）DEAE-葡萄糖法（4）脂质体介导基因导入（5）显微注射法46 在大肠杆菌中表达外源基因，主要考虑以下基本要素：（1）目的基因如果来自真核细胞必须是 cDNA，因为大肠杆菌没有剪切内含子的功能。 （2）从真核基因转录的 mRNA缺乏结合细菌核糖体的 SD 序列，因此，cDNA 的起始密码子（ATG）上游部分（5 端非编码区）是无用的，必须除去。（3）所用表达载体必须是大肠杆菌表达载体。含有大肠杆菌 RNA 聚合酶所能识别的启动子和 SD 序列。47 寡核苷酸介导的诱变技术步骤：（1）将目的 DNA 片段插入 M13 噬菌体载体；（2）以重组噬菌体制备单链 DNA；（3）设计并合成

23、诱变寡核苷酸引物；（4）诱变寡核苷酸引物与靶单链 DNA 杂交；（5）利用 Klenow 片段在杂交的寡核苷酸上延伸；（6）用 T4DNA 连接酶将新合成的杂合双链 DNA 连接成双链闭环 DNA 分子；（7）转化宿主细菌；（8）筛选含有诱变 DNA 片段的重组噬菌体；（9）以含有诱变 DNA 的重组噬菌体制备单链 DNA；（10）测序证实 M13 噬菌体 DNA 带有目标诱变而无其它诱变。最后从重组 M13 噬菌体 RF 型 DNA 中回收诱变的 DNA 片段，克隆到其它适当的载体中，对诱变 DNA 片段进行进一步研究。48 双脱氧链终止法基本原理：和模板互补结合的引物在 DNA 聚合酶作用

24、下发生互补链的延伸反应，反应体系中的2，3-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）与底物脱氧核苷三磷酸竞争结合于延伸互补链末端，造成延伸终止。由于产生一系列分别终止于 A、G、C、T 位置的不同大小的 DNA 片段，应用高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳可分辨仅相差一个核苷酸的 20-500 碱基的 DNA 片段，结合放射自显影技术，便能直接读出模板 DNA 的待测序列。双脱氧终止法测定 DNA 序列的片段通常克隆于 M13 或质粒 pUC 载体，利用多克隆位点两侧的通用引物进行测序反应。较长链的待测 DNA 片段可采用随机法、嵌套缺失法和引物延伸法进行序列测定。Maxam-Gilbert 法基本原理：采用化

25、学试剂处理末端放射标记的 DN单链片段，造成碱基特异性切割，由此产生一组具不同长度的链的反应混合物，经凝胶电泳按分子大小分离和放射自显影，直接读出待测的核苷酸顺序。激光测序技术：应用荧光基团标记引物或种 dd，采用双脱氧链终止法原理进行测序反应，双脱氧核苷酸终止产物经荧光激发产生信号，通过计算机自动读出被测序列。 温度对复性（杂交）的影响：温度过高不利于核酸复性，而温度过低，少数碱基配对形成的局部双链不易解离，适宜的复性温度是较m 值低。在度时杂交进行非常缓慢，随着温度的升高，杂交率也明显增加，当温度比m 值低度时，杂交达到最高杂交率。但在更高温度情况下，双链分子逐渐趋向解链，当温度达到m度时

26、杂交率即非常低。 （）错配率第增加，m 值应相应下降度；（）杂交体的稳定性较的稳定性高，m 值应相应增加度；（）杂交体的m 值应相应增加度，因此，采用探针时，加入适量的甲酰胺以降低m 值是必需的；（）寡核苷酸探针的碱基数很少，可以采用下式计算寡核苷酸探针m 值：m=4*(G+C)+2*(A+T)；寡核苷酸探针杂交反应一般在低于m 值度下进行。 常用的outhern 转膜方法：（）毛细管虹吸印迹法：（）电转印法（）真空转移法 outhernNorthern 印迹法区别：（） 靶核酸：所检测的靶核酸是，是（）电泳：样品依其分子量大小在变性胶中进行分离，凝胶中需加入变性剂，防止分子形成二级结构，维持

27、其单链线性状态。 （）转膜：电泳结束后，不需要再进行变性和中和，直接采用毛细管虹吸法将胶中的转移到膜上，也可采用电转移或真空转移法。 核酸原位杂交步骤：（）组织或细胞的固定（）组织细胞杂交前的预处理（）探针的选择和标记（）杂交（）杂交结果检测。 酶保护分析法（）基本程序步骤：（）制备待测（）探针的标记（）杂交（）除去单链（）电泳分析 探针及标记物的种类：探针（）c探针（）基因组探针（）寡核苷酸探针（）探针。标记物：（）核素标记物（）非核素标记物：半抗原、配体、荧光素、化学发光探针。核酸体外标记法分为化学法和酶法：（）化学法：利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的基团（如磷酸基团）发生的化学反

28、应将标记物直接结合到探针分子上。 （）酶法（酶促标记法）：将标记物预先标记在核酸苷酸（或 d）分子上，然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子掺入到探针分子中去，或将核苷酸分子上的标记基团交换到探针分子上。 酶促标记法：（）缺口平移法；（）随机引物法（）标记法（）末端标记法缺口平移法原理：利用适当浓度的ase在双链上随机切割单链，造成单链切口。切口处产生一个末端和一个末端，末端即可作为引物，在大肠杆菌聚合酶的聚合酶活性的催化下，以互补的单链为模板，依次将 dNTP 连接到切口的端羟基上，合成新的单链；同时聚合酶的核酸外切酶活性在切口处将旧链人末端逐步切除，新合成链不断延伸，从而使原分子上的部分核苷酸

29、残基被标记的核苷酸所取代。 基本过程：（）变性：通过加热至度左右，使双螺旋的氢键断裂，形成单链，作为反应的模板。 （）退火：将温度降至引物的m 值左右或以下，引物与模板互补区域结合，形成杂交链。（）延伸：当反应体系温度升至度左右时，aqDNA 聚合酶催化以引物为起始点的链延伸反应，形成新生链。 引物设计的基本要求：（）引物长度一般为个核苷酸。 （）引物中的碱基组成尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积现象。 （）引物自身不应存在互补序列，尤其应避免折叠成发夹结构。 （）两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免端的互补重叠。 （）引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过，引物末端连续个碱基在

30、待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增（）引物端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板配对（）引物与模板结合时，引物的端最多可以游离十几个碱基而不影响反应的进行。技术的要类型：（）筑巢（）共享引物（）多重（）不对称（）锚定（）反向（）彩色（）原位（）定量（）差异显示（）重组。 反应体系包括：核酸模板、引物、aq聚合酶、缓冲液、g 2+、d s、反应温度与循环次数。 转基因动物及基本原理：转基因动物是指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物。基本原理：将目的基因（或基因组片段）用显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中，使目的基因整合到基因

31、组中，然后将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体动物园的输卵管（或子宫）中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物。导入基因的方法有显微注射法、胚胎干细胞法、逆转录病毒感染法、精子载体法。转基因动物中外源的检测：（）染色体及基因水平的检测：斑点杂交、outhern 杂交和分析、原位杂交等；（）转录水平的检测：利用 Northern 杂交、RNase 保护分析及方法检测转基因 mRNA 的存在及表达水平。 （）蛋白质水平检测，采用 Western 印迹分析法。 转基因动物的应用：（）对基因组织或阶段特异表达的研究（）通过研究转入外源基因后的新表型，可以发现基因的新功能；（）导入外源基因后，由于基因

32、的随机插入，可能会导致内源基因的突变，对这些突变表型进行分析，可以发现新的基因（）可用于只在胚胎期才表达的基因的结构和功能的研究（）建立研究外源基因表达、调控的动物模型（）对遗传性疾病的研究（）建立人类疾病的动物模型， （）动物新品种的培育（）基因产品的制备（）在免疫学中，可用于对免疫机制、免疫相关疾病的研究及建立免疫性疾病动物模型等。 转基因植物技术路线：（）选择及获得外源目的基因， （）受体细胞培养， （）选用适当的转基因方法将目的基因导入受体细胞（）将转化细胞进行适当培养（）筛选阳性转化细胞（）培植阳性转化植株（）转基因植株的鉴定。转基因植物在医学上的应用：（）可成为新的疫苗来源，植物病

33、毒也成为人类疫苗的可能来源（）因为植物病毒对动物不致病，因此可利用植物病毒表达抗原蛋白的片段，以诱导哺乳动物免疫系统发生反应。 （）还可产生单抗，作为化疗药物的靶向载体。基因打靶的必备条件：（）胚胎干细胞：细胞的特点：能在体外培养，并保留发育的全能性。体外培养要维持细胞的分裂增殖与正常的核型，同时抑制细胞的分化。 （）打靶载体：a、neo 阳性筛选标志：b、tk阴性筛选标志： 构建打靶载体的基本过程：（）获得目的基因（待敲除基因）的同源片段，将此片段克隆到一般的质粒载体中；（）从重组质粒中切除目的基因的大部分同源序列，只留部分序列在线性质粒载体的两端；（）将 neo 基因克隆到带有目的基因同源

34、顺序的线性质粒中，使之位于残留目的基因同源顺序的中间；（）在目的基因同源顺序的外侧线性化重组质粒载体，将tk 基因克隆到此线性载体中。 芯片技术的应用：（）序列测定（）基因表达分析（）基因组研究（）基因诊断（）药物研究与开发（药物筛选、新药发现、合理用药、中草药鉴定和真假药辨别）引起一级结构变异的诱变剂的作用机制：（）碱基类似物诱发突变（）改变的化学结构（）结合到分子上诱发移码突变（）紫外线及其其它射线引起的分子变化。 突变类型：点突变（转换和颠换） 、缺失（一个碱基或一段核苷酸链从大分子上消失） 、插入（一个原来没有的碱基或一段原来没有的核苷酸链插入大分子中间） 、倒位（链内重组，使其中一段

35、方向反置） 突变所引起的遗传效应包括：（）遗传密码的改变：错义突变、无义突变、同义突变、移码突变；（）对mRNA 剪接的影响（3）蛋白质肽链中的片段缺失。72 病毒癌基因与细胞癌基因的不同之处：（） 病毒癌基因与细胞癌基因相比，通常丢失了两端的某些序列。 （2）病毒癌基因没有内含子，而细胞癌基因中通常含有内含子或插入序列。 （3）病毒癌基因与同源的细胞原癌基因在外显子序列中也有微小的差别。 （4）病毒癌基因常会出现碱基取代或碱基缺失等突变，而细胞癌基因则较少发现这一类突变。73 癌基因家族：srcrasmycsiserbmyb.74 RB 抑癌基因机制：RB 蛋白在静止细胞中与 E2F 结合成

36、复合物，抑制 E2F 的转录活性；P105-RB 通过抑制多种原癌基因如 c-mycc-fos 的表达而抑制细胞增殖。75 P53 抑制细胞生长机制：（1）P53 蛋白可抑制 cyclinA 的表达，故 P53 基因的变异或缺失，可使 cyclinA 过量表达而促进细胞在 DNA 复制不完全时即进入 M 期而致癌， （2）P53 能阻碍 DNA 聚合酶与 DNA 复制起始复合物的结合而抑制 DNA 复制的启动，进而阻止 DNA 的复制。 （3）P53 的酸性氨基酸末端结构区具有转录激活作用，它能激活一些抑制细胞分裂的基因而间接抑制细胞增殖。 （4）正常 P53 还能抑制 c-mycras 基因

37、或腺病毒 E1A 对细胞的转化作用。76 癌基因活化致癌的主要机制：（1）原癌基因点突变（2）原癌基因获得外源启动子而激活（3）原癌基因因甲基化程度降低而激活（4）原癌基因的拷贝数增加（5）基因易位或重排使原癌基因激活77 肿瘤发生的多基因协同作用：该假说认为细胞癌变是多步骤、多重打击的复杂过程，在肿瘤发生发展的各阶段，至少需要两个或多个不 同的癌相关基因的异常激活或失活，才有可能引起细胞的癌变。直肠结肠癌的发生、发展过程可分 6 个阶段：上皮细胞过度增生、早期腺瘤、中期腺瘤、晚期腺瘤、腺癌和转移癌。从正常上皮细胞到上皮细胞过度增生可能涉及 FAP 基因异常（突变或失活） ，从早期腺瘤到中期腺

38、瘤涉及 K-ras 的异常（突变） ，从中期腺瘤到晚期腺瘤涉及 DCC 基因异常（如丢失） ，从晚期腺瘤到直肠结肠癌涉及 P53 基因异常（丢失），癌转移还涉及到其它基因的激活与失活，如 nm23 基因表达异常、血管生长因子基因表达在肿瘤细胞表达的 Ras 刺激下增高等。78 基因诊断中常用的分子生物学技术（1）核酸分子杂交（2）聚合酶链反就（PCR） （3）单链构象多态性检测（4）限制酶酶谱分析（5）DNA 序列测定（6）DNA 芯片技术79 DNA 指纹特点：（1）一个 DNA 指纹探针可同时检测十几个、甚至几十个位点的变异， （2）具有高度特异性（3）具有稳定的遗传性（4）DNA 指纹图

39、谱具有体细胞稳定性。80 基因诊断的方法包括：（1）基因突变检测；（2）多态性分析（3）基因表达的检测（4）外源 DNA 的检测。81 基因诊断策略：一、遗传性疾病：（1）直接诊断策略，即直接检测导致遗传病发生的各种基因突变；（2）间接诊断策略，即寻找具有基因缺陷的染色体并判断被检者是否具有这条染色体。二、感染性疾病：针对病原体的基因序列，设计特异性探针进行分子杂交或合成特异的寡核苷酸引物进行 PCR 扩增，即能对该疾病作出明确的病原体诊断；三肿瘤：（1）检测肿瘤相关基因的突变及表达异常（2）检测肿瘤相关病毒基因（3）检测肿瘤标记物基因。四、法医：应用 DNA 多态性分析、DNA 指纹技术。8

40、2 基因置换的条件：（1）对导入的基因及其产物有详尽的了解；（2）外来基因能有效地导入靶细胞（3）导入基因能在靶细胞中长期稳定驻留（4）导入基因能有适度水平的表达（5）基因导入的方法及所用载体对宿主细胞安全无害。83 选择转移基因的靶细胞时，一般考虑以下几个因素（1）不管是直接体内还是间接体内基因转移，选择目的基因表达的组织细胞，最好是组织特异性细胞， （2）细胞较易获得，县城生命周期较长。 （3）离体细胞较易受外源遗传物质转化。 （4）离体细胞经转染和一定时间培养后再植回体内仍较易成活。目前常用的靶细胞：造血细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞、肌肉细胞、肿瘤细胞。84 反义 RNA 在基因治疗中的意义和需解决的问题及前景：通过反义 RNA 结合细胞中特异 mRNA 而调控其翻译，可望按剂量来调节特定基因的表达或功能。问题是：（1）专一性转移问题（2）反义 RNA 进入靶细胞前的降解问题。 （3）受体介导反义 RNA 转移技术。前景：（1）安全性高（2）反义 RNA 设计和制备方便（3）具有剂量调节效应（4）能直接作用于一些 RNA 病毒。