干旱胁迫对小麦幼苗的影响.doc

1、干旱胁迫对小麦幼苗生理生化指标的影响杨万坤 114120238 11 应用生物教育 A 班摘要：用小麦幼苗为实验材料，研究干旱胁迫对小麦幼苗生理生化指标的影响。试验结果表明：在干旱胁迫(5 天)下小麦幼苗中脯氨酸（Pro） 、丙二醛（MDA） 、过氧化氢（H 2O2） 、抗氧化酶（PPO、POD） 、谷胱甘肽(GSH)、ASA 的含量都较正常情况下小麦幼苗的含量高。关键字：干旱胁迫、小麦幼苗、Pro、MDA、H 2O2、PPO、POD、GSH、ASA引言：小麦是我国北方地区的主要粮食作物，但是近几年北方地区旱情日益严重，小麦产量安全问题日益突出。干旱也属于逆境，水分在植物的生命活动中占主导地位

2、，大多数植物遭受干旱逆境后各个生理过程都会受到不同程度的影响。干旱是我国农业可持续发展面临的主要问题之一, 干旱胁迫对植物的影响是一个复杂的生理生化过程, 涉及到许多生物大分子和小分子 【1】 。干旱胁迫对植物的影响主要体现在酶活性、膜系统、细胞失水等，导致细胞代谢紊乱，甚至是细胞死亡。本次试验测定正常生长的小麦幼苗和干旱胁迫处理小麦幼苗中脯氨酸（Pro） 、丙二醛（MDA） 、过氧化氢、抗氧化酶（PPO、POD） 、谷胱甘肽(GSH)、ASA 的含量变化, 来研究干旱胁迫对小麦的影响，从而找到合适的方法来解决干旱胁迫问题，解决小麦生产安全问题提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料及处理将小

3、麦种子用 0.1% HgCl2消毒 10 min 后，用蒸馏水漂洗干净，用蒸馏水于 26下吸涨 12 h，然后播于垫有 6 层湿润滤纸的带盖白磁盘（24cm16cm）中 于 26 下暗萌发 60h，计算发芽率（注意与前面结果比较） ，选取长势一致的小麦幼苗做干旱 5 天干旱处理。 5 天后用相同的方法分别对实验组和对照组的小麦进行脯氨酸、MDA、过氧化氢、抗氧化酶（PPO、POD） 、GSH、ASA 的含量的测定。1.2 测定方法1.21 玉米种子发芽率的测定各取 50 粒吸胀的玉米种子沿胚的中心线切成两半（严格区分两个半粒） ，进行下列实验：其中 50 个半粒进行 TTC 染色（30水浴 2

4、0 min） ，另 50 个半粒进行曙红染色（室温染色 10 min）洗净后观察。 根据两种方法的染色情况，分别计算发芽率。1.22 小麦幼苗脯氨酸含量的测定分别取 0.1 g 实验组和对照组的胚芽鞘加入 3 ml 3%磺基水杨酸（SSA）和少许石英砂充分研磨用 2 ml 3% SSA 洗研钵 5000 rpm 离心 10 min 量上清液体积。 测定：上清液各 2 ml 分别加入 2 ml 冰乙酸和 2 ml 茚三酮试剂煮沸15 min冷却后 5000 rpm 离心 10 min（若没沉淀可省略次步骤） 分别测定 A520,将测得的结果用公式Pro content = 用总显 VWLA520

5、（umol.g -1FW）计算出正常和干旱生长小麦的胚芽鞘的脯氨酸含量。1.23 小麦幼苗 MDA 含量的测定分别取 0.1 g 实验组和对照组加入 3 ml10TCA (和少许石英砂充分研磨用 2 ml10TCA 洗研钵 5000 rpm 离心 10 min 量上清液体积。 测定：分别取上清液各 2 ml 加入 0.6%TBA（用 10% TCA 配制） 2 ml煮沸 15 min冷却后5000 rpm 离心 10 min 分别测定 OD450和 OD532将测得的 D450和 OD532的数据带入下列公式OD450=C1x 85.4 OD532 = C1x 7.4C 2X155000求解方

6、程得：C 1/(mmol/L)=11.71 OD450C2/(umol/L)=6.45 OD5320.56 OD450计算出 C1可溶性糖的浓度，C 2为 MDA 的浓度。1.24 小麦幼苗 H2O2测定分别取 0.51g 实验组和对照组加入 3 ml 0.3% TCA 和少许石英砂充分研磨用 2 ml 0.3% TCA 洗研钵 5000 rpm 离心 10 min 量上清液体积。测定：分别取上清液各 4ml 加入 0.1%Ti(SO4)2 用 20%(v/v) H2SO4配制 1 ml摇匀 5000 rpm 离心 10 min OD 410将测得的 OD410值带入下列公式H2O2 cont

7、ent = 用总显 VWLA410（ umol.g-1FW）计算出 H2O2酶的含量。1.25 小麦幼苗抗氧化酶的测定1、分别取 0.1 g 实验材料 加入少许石英砂和 3 ml 提取液（50mmol/L PBS, pH6.0,内含 0.1mmol/ LEDTA, 1%PVP） 充分研磨 转入离心管中用 2 ml 提取液洗研钵 5000 rpm 离心 10 min 量上清液体积用于测定POD 和 PPO 酶活性或分装后转至 -20 或-80保存。2、POD 测定：取 POD 反应混合液（10 mmol/L 愈创木酚，5 mmol/L H2O2,用 PBS 溶解）2.95 ml，加入酶液 50

8、ul（空白调零用 PBS 取代） ，立即记时，摇匀，每过 1 min 记录一次在 A470的读数值。3、PPO 测定：取 PPO 反应混合液（ 20 mmol/L 邻苯二酚，用 PBS 溶解）2.9ml，加入酶液 0.1 ml（空白调零用 PBS 取代） ，立即记时，摇匀，每过 30s记录一次在 A410的读数值。以每分钟 A 值变化 0.01 所需要的酶液的量为一个活力单位（U） ，则：将测得的 A470和 A410数据带入公式POD activities= 用总显 VtW470（umol.g-1FW）的PPO activies= 用总VtWA01.40(U.g-1FW)计算出 PPO 和

9、POD 的值1.26 小麦幼苗 GSH 的测定分别取 0.1 g 实验组和对照组的胚芽鞘加入 3 ml 5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂充分研磨用 2 ml 5% TCA 洗研钵 5000 rpm 离心 10 min 量上清液体积。测定：上清液各 1 ml （空白用 5% TCA 代替） 分别加入 2ml0.1M PBS (pH=7.7) 1 ml 2 mM DTNB 25 5 min测定 A412将测得的 A412值带入公式GSH content= 用总显 VWL412(umol.g-1FW)将 GSH 的值计算出来1.27 小麦幼苗 ASA 的测定 ASA 的提取：分别取 0.2 g 实

10、验组和对照组的胚芽鞘 加入 3 ml 5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂充分研磨用 2 ml 5% TCA 洗研钵 5000 rpm 离心 10 min 量上清液体积。 测定：上清液各 0.8 ml (空白用 5% TCA 代替) 分别加入 0.8 ml 0.15 M NaH2PO4 (pH=7.4) 和蒸馏水 摇匀 分别加入 0.8 ml 5% TCA、44%磷酸和 4%联吡啶 摇匀 加入 3%FeCl3 0.8 ml 37 15 min 测定 A525 ASA content = 用总显 VWL52(umol.g-1FW)2、结果与分析发芽率的测定：TTC 染色法：44 个具有活力。曙红染

11、色法：44 个具有活力。分别计算两种方法的发芽率：TTC 法 44 /50100%=88%；曙红染色法 44 / 50100%=88%。用两种方法测得的种子发芽率是一样的，都为 88%,说明这一批种子的生命活力较高。脯氨酸含量测定：组别 A520 V 总 V 显 V 用 Pro content干旱组 1.842 4.8 ml 6ml 2ml 0.08187 mol.g-1FW对照组 0.018 5.3 ml 6ml 2ml 0.00088 mol.g-1FWPro content00.020.040.060.080.1干 旱 组 对 照 组Procontent(umol.g-1FW)计算结果为

12、干旱组脯氨酸含量为 0.08187 mol.g-1FW，对照组脯氨酸含量为0.00088 mol.g-1FW. 实验组与对照组比较，可以看出实验组的脯氨酸含量是对照组的 93 倍。MDA 含量的测定：结果 数据组别 OD532 OD450 C1 C2干旱组 0.303 1.367 16.007 mmol/L 1.189 mol/L对照组 0.029 0.038 0.445 mmol/L 0.166 mol/L由上表可知干旱组的 MDA 的浓度为 1.189 mol/L，对照组的 MDA 的浓度为 0.166 mol/L，干旱组为对照组的 7 倍左右，说明当遇到干旱胁迫时小麦幼苗中 MDA 含量

13、比正常生长的含量高。H2O2测定：组别 V 总 V 用 V 显OD410 H2O2 content干旱组 3. 8ml 3.8 ml 4ml 0.980 0.14 mol.g-1FW对照组 4.7 ml 4 ml 4.2ml 0.202 0.0356 mol.g-1FWH2O2 content00.020.040.060.080.10.120.140.16干 旱 组 对 照 组H2O2测定(mol.g-1FW)丙 二 醛 （ C2）00.20.40.60.811.21.4干 旱 组 对 照 组丙二醛 umol/L）上述计算结果得到干旱组中 H2O2为 0.14 umol.g-1FW，对照组中

14、H2O2为0.0356umol.g-1FW，干旱组为对照组的 4 倍左右，说明当遇到干旱胁迫时小麦幼苗中 H2O2含量迅速成倍上升。抗氧化酶的测定V 总 V 用 V 显干旱组 4.6ml 0.05 ml 3mlPOD对照组 4.6ml 0.05 ml 3ml干旱组 4.6ml 0.1 ml 3mlPPO对照组 4.6ml 0.1 ml 3mlPOD 在不同时间的 A470值：时间和结果组别 1 min 2 min 3min 4min POD activities（t=4min）干旱组 1.22 1.61 1.86 2.565 0.0456umol.g-1FWmin-1对照组 1.03 1.52

15、8 1.789 2.202 0.0342umol.g-1FWmin-1PPO 在不同时间的 A410值：时间和结果组别 0.5min 1min 1.5min 2min PPO activities(t=2min)干旱组 0.041 0.082 0.118 0.147 3250.7 U.g-1FW对照组 0.042 0.082 0.109 0.132 2790.7U.g-1FWPOD activities（ t=4min）00.010.020.030.040.05干 旱 组 对 照 组PODactivities（umol.g-1FWmin-1）PPO activities(t=2min)2500

16、26002700280029003000310032003300干 旱 组 对 照 组PPO activities(U.g-1FW)由上表可知当小麦幼苗遭受干旱胁迫时，抗氧化酶（POD,PPO）含量有明显上升。GSH 的测定组别 V 总 V 用 V 显A412 GSH content干旱组 4.3ml 1ml 4ml 0.207 0.0026umol.g-1FW对照组 4.3 ml 1ml 4ml 0.024 0.00031umol.g-1FW由上述计算结果可知受到干旱胁迫的小麦幼苗的胚芽鞘中 GSH 含量是正常生长的 8 倍左右，表明遭受干旱胁迫时小麦幼苗中 GSH 含量迅速上升。ASA 的

17、测定组别 V 总 V 显 V 用 WA525 ASA content干旱组 4.4ml 5.6ml 0.8ml 0.2g 0.106 0.00098umol.g-1FW对照组 5.2ml 5.6ml 0.8ml 0.2g 0.024 0.00026umol.g-1FW由上述计算结果可知受到干旱胁迫的小麦幼苗中 ASA 的含量是正常生长的4倍左右，表明遭受干旱胁迫时小麦幼苗中 ASA 含量迅速上升。3、讨论ASA content00.00020.00040.00060.00080.0010.0012干 旱 组 对 照 组ASAcontent(umol.g-1FW)GSH content00.00

18、050.0010.00150.0020.00250.003干 旱 组 对 照 组GSH content(umol.g-1FW)测定玉米发芽率时所用的两种方法：TTC 染色法和曙红染色法测得发芽率均为 88%。TTC 染色法的染色部位是胚，染色较深，能清晰判别胚的死活，曙红染色法的染色部位是胚乳，着色较浅。实验中玉米用两种方法都发现有部分玉米胚细胞坏死，但主要在子叶部分，少许在胚根处（判断为不能正常发芽生长） ，这批玉米种子可能因为储存时间过长或其他因素造成影响，影响其发芽率，但总体来说这批种子发芽率很高。本次实验结果中当小麦幼苗遭受干旱胁迫时，脯氨酸含量增高，其中脯氨酸含量是正常生长小麦幼苗的

19、93倍，这一结果与洪法水、李樊和在研究自然干旱胁迫下小麦品种游离脯氨酸与抗旱性的关系所得到的结果基本相似 【2】 。科学研究发现：脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，具有很强的水合能力，其水溶液具有很高的水势。脯氨酸的疏水端可与蛋白质结合，亲水端可与水分子结合，蛋白质可借助脯氨酸束缚更多的水，从而防止渗透胁迫条件下蛋白质的脱水变性。因此脯氨酸在植物的渗透调节中起重要作用，而且即使在含水量很低的细胞内，脯氨酸溶液仍能提供足够的自由水，以维持正常的生命活动。正常情况下，植物体内脯氨酸含量并不高，但遭受干旱等胁迫时，脯氨酸含量明显增加。Mattioni研究发现,小麦幼苗在水分胁迫下,氨基酸都有所积累, 但

20、Pro积累更多。P5C(吡咯啉-5-羧酸还原酶) 和脯氨酸脱氢酶是控制 Pro生物合成和分解的酶。在水分胁迫下, P5C活性增强而脱氢酶活性受抑制, 导致Pro增加 【3】 。这些说明在遭受干旱胁迫时，小麦幼苗通过增加细胞中的Pro含量来抵御干旱胁迫。实验结果表明干旱胁迫下生长的小麦胚芽鞘内所含的MDA量比正常生长的小麦所含量高（约为7倍） 。科学研究表明：植物器官在逆境条件下 , 往往发生膜脂过氧化作用 ,丙二醛 (MDA ) 是其主要产物，具有很强的细胞毒性 ,对膜和细胞中的许多生物功能分子如蛋白质、核酸和酶等均具有很强的破坏作用 。故 MDA含量可以作为鉴定小麦抗旱性能指标之一，含量低时

21、表明小麦的抗氧化能力强，抗旱性也强 【4】 。MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害，其含量的多少代表膜损害程度，本次实验研究数据说明，干旱使小麦细胞膜系统受到一定的损害。试验结果表明当小麦幼苗遭受干旱胁迫时，H 2O2含量上升（约是对照组的4倍） 。过氧化氢酶大量分布于动植物细胞内，属于活性氧清除剂，对H 2O2和羟自由基有清除能力，是一种细胞保护酶。大部分研究干旱胁迫对植物幼苗保护酶活性影响已经证明，在干旱胁迫中植物体中的过氧化氢酶活性前期升高，但到后期呈下降趋势。这间接证明干旱会使植物体积累过氧化氢。H 2O2 过氧化氢是植物代谢中产生的一种产物，其积累对细胞具有氧化破坏作用，在实验中

22、，可根据其值的变化，来了解组织的破坏程度。因此，过氧化氢的含量也是植物逆境的一项指标。与CK相比,干旱胁迫处理的活性氧超氧阴离子（O 2-）和过氧化氢(H 2O2)逐渐积累 【5】 .说明在干旱胁迫细胞有氧代谢加快，H 2O2含量增加显著。由实验结果可知干旱组和对照组的抗氧化酶 POD 含量无明显增加、PPO 活性有着明显增加。PPO 和 POD 均为植物内源自由基清除剂, 属于保护酶系统 【6】 。在逆境中保护酶活性增强或维持较高的水平, 能够清除活性氧自由基使之保持较低的水平, 维持细胞膜的稳定性和完整性。在干旱胁迫下，由于抗氧化酶与ROS 的动态平衡被打破，造成抗氧化酶（PPO、POD）

23、的积累。在干旱胁迫下PPO、POD 含量上升，POD 催化其它底物与 H2O2反应以消耗 H2O2植物在受水胁迫及时复水，可诱导体内 POD 活性上升，从而起到保护植物的作用。POD 活性在干旱胁迫下增强, 能通过增强 POD 活性来抵御干旱逆境对其所造成的伤害 【7】 。多酚氧化酶( polphenol oxidase , PPO ) 是植物体内酚类物质氧化或缩合以及木质素合成的重要酶, 提高 PPO 活性可促进植株体内酚类物质和木质素的合成和累积以提高植物抗性 【8】 。本实验中 POD、PPO 含量均上升，但增加量不是很明显，可能是由于在测定时测 PPO、POD 顺序（先拉出测的二者读数

24、，隔半分钟后推进去读二者的读数，使二者读数的时间间隔不同）不同，使二者的读数间隔相差较大，造成二者的读数不同。实验结果表明遭受干旱胁迫时小麦幼苗中 GSH 含量迅速上升，干旱胁迫的小麦幼苗的胚芽鞘中 GSH 含量是正常生长的 8 倍。在植物体内活性氧的清除包括酶系统与非酶系统，而谷胱甘肽（GSH）则是非酶系统中活性氧清除的重要抗氧化剂之一。GSH 不仅可以直接清除 H2O2，在叶绿体中还可以与抗坏血酸协同作用清除 H2O2。对于 GSH 含量的测定，是一个良好的表示抗氧化胁迫的指标。研究表明在水分胁迫下，GSH 含量能增加至 50 倍以上，可提高植物的抗氧化能力 【9】 。本实验验证在干旱胁迫

25、下小麦幼苗中 GSH 含量比正常显著升高。实验结果表明在干旱胁迫下小麦幼苗中 ASA 含量比对照组的小麦幼苗 4 倍，含量明显上升。在姜晶、张宪政的实验中随着水分亏缺天数的增加，可明显降低超氧阴离子自由基（ - ）的含量；提高超氧化物歧化酶（）和过氧化物酶（）的活性；降低脂氧合酶（） 、酸性磷酯酶和过氧化氢酶活性；降低膜脂过氧化主要产物丙二醛（）的含量，同时使过氧化氢（ ）的含量有所增加。使膜结构与功能在水分亏缺下得到保护，从而提高了小麦的抗旱性 【10】 。汪晓峰和张宪政研究了外源对小麦的抗旱生理作用的实验结果表明：在水分胁迫下，可缓解小麦水分下降趋势，提高叶绿素和蛋白质含量，抑制 的增加，

26、同时提高保护酶的活性，处理还可降低水分胁迫下外渗电导率，对膜起保护作用 【11】 。翁明阳的实验中，不同抗旱性品种小麦幼苗叶片的抗坏血酸（ASA）含量变化趋势有相似之处，随着干旱胁迫时期的延长，四个抗旱性不同品种都是先上升，到胁迫第4d 有回落后，在胁迫第 5、6d 继续上升 【12】 。本次实验结果与之相同，说明在遭受干旱胁迫时，小麦幼苗本身会合成大量 ASA 来抵御干旱。这次实验表明在干旱胁迫下, 小麦幼苗生长受到一定抑制作用,生理生化指标发生一系列变化, 表现为小麦幼苗胚芽鞘中脯氨酸、丙二醛 (MDA) 、H 2O2、GSH、过氧化酶（POD、PPO） 、GSA 含量在干旱胁迫下含量较正

27、常情况下的明显升高。4、参考文献【1】田士林, 李莉. PEG6000渗透胁迫对小麦抗旱性的影响 J . 湖北农业科学, 2008, 7( 1) : 19- 21.【2】洪法水,李樊和 自然干旱胁迫下小麦品种游离脯氨酸与抗旱性的关系 安徽农业技术师范学院 1991.【3】张林刚, 邓西平 小麦抗旱性生理生化研究进展 干旱地区农业研究 2000 年 9 月 第 18 卷第 3 期 88 页【4】Chen Z, et al . The A scorbic acid redox state controls guard cell signaling and stomatal movement . P

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