微透析技术.doc

1、微透析技术2014/5/18 1微透析技术一、微透析技术微透析(Microdialysis)技术是一种将灌流取样和透析技术结合起来并逐渐完善的一种从生物活体内进行动态微量生化取样的新技术。具有活体连续取样、动态观察、定量分析、采样量小、组织损伤轻等特点。可在麻醉或清醒的生物体上使用， 特别适合于深部组织和重要器官的活体生化研究。 目前已成为实验神经生理学和神经化学的重要研究工具之一, 它可提供递质释放、摄取和代谢的必要信息。 1、主要原理以透析原理作为基础，通过对插入生物体内中的微透析探头在非平衡条件下进行灌流，物质沿浓度梯度逆向扩散，使被分析物质穿过膜扩散进入透析管内,并被透析管内连续流动的

2、灌流液不断带出，从而达到活体组织取样的目的。2、微透析系统及其特点 2.1、微透析系统装置主要由微量泵、微透析探头、收集器、连接管及配套设备组成。2.1.1、微量泵以注射泵为佳,有利于减少恒流泵和蠕动泵的波动, 流速一般为 15 l/min。2.1.2、微透析探头有直线性探头、环形探头、同心型探头等不同的类型(微透析管因实验对象不同而形状大小各异)；按照探头的形状分为穿颅探头、U 型探头、I 型探头、环形探头等。目前普遍应用的是同心型探头，微透析探头通常是由一管式半透膜与不锈钢、石英或塑料毛细管构成双层管道； 长度一般为 110 cm。半透膜由再生纤维素、聚碳酸酯或聚丙烯腈制成, 载留分子量

3、510 KD 不等。实际应用需根据具体组织和待测物选择不同的微透析探头。微透析技术最大的优点是可在基本上不干扰体内正常生命过程的情况下进行在体( in vivo)、实时( real time) 和在线(on line) 取样, 特别适用于研究生命过程的动态变化。微透析技术的优点是活体取样、动态观察、定量分析、采样量小、组织损伤轻等。该技术的另一大优点是样品的采集与分析过程既可在位又可离位进行。此外微透析技术的独到之处是可以单独取得细胞外液, 因此可对体内神经递质的释放量进行动态监测, 具有重要的生物学意义。微透析技术的缺点就是对取出的样品进行准确可靠的校正，主要涉及到对探针的回收率的测定。探针

4、回收率是指从灌流液中流出的待测组分与标准浓度之比的百分数。探针回收率是 影响 微透析结果的重要因素, 取决于取样部位的生物学性质、透析膜的物理性质微透析技术2014/5/18 2(材料、孔径、长度及几何形状等)、待测物质的分子量、灌流速度、压力、生物体本身的健康条件和生物节律等。目前测定回收率的方法主要有以下几种：(1)、外标法计算被测物质相对浓度的变化时, 可简单地采用体外回收率法。测定宜在取样后立即进行, 将探针放入已知浓度的标准溶液中, 用与体内实验相同的流速灌流探针。达到稳定状态后收集灌流液并进行检测。测定浓度与标准溶液浓度之比就是体外回收率。此法虽简单易行, 但由于被测物质在体外时与

5、体内的环境状况不同, 检测结果不能严格地等同于实际的回收率。(2)、内标法往灌流液中加入已知浓度且性质与被分析物质相似的另一种物质做内标,内标物不仅在扩散性质上与被分析物一致,而且还要在体内的代谢过程中也尽可能一致,测出透析率即作为被分析物的回收率。由于选择内标的局限性很大, 限制了此法的应用。(3)、反透析法假设被测物从两个方向通过半透膜是同等的。在灌流液中加入一定浓度的内标物(Cic) ,在与体内透析相同的条件下操作, 测定透析液中内标物的浓度(Cec) ,体内回收率(Rin ,vivo ) 可用下式计算：Rin vivo = (1 Cec/ Cic) 100 %本法要求内标物具有生物惰性

6、, 尽可能与被测物相似。(4)、低流速法低流速法是将灌流速度尽量降低, 一般控制在 50 nl/min 以下, 使回收率尽量达到100% , 此时便无需进行回收率校正了。此法取样体积很少(一般在 5 l 以下) , 不但对仪器的检测灵敏度要求极高, 而且取样时间长易造成样品的挥发或氧化。此外还有外推至零流速法(extrapolation to zero flow)和零净通量法(zero - net flux)。微透析只是一项取样技术，要进行体内物质测定必须要与分析仪器联用，以便于有利于对微量样品进行实时和在线分析测定，减少操作误差。微透析时选取适当微透析膜的截留分子量, 免除了复杂的样品前处理

7、及由此而产生的样品损失和误差, 也不会因在室温取样而酶解, 提高了样品的稳定性,使微透析液中可不含蛋白质和酶等生物大分子, 同时由于微透析取出的样品体积小，约为 l 级，易于挥发，因此取出后不易久放，能直接进入分析仪器进行测定。常用的有高效液相色谱(HPLC) 、毛细管电泳(CE) 、质谱（MS）及激光诱导的荧光检测器等,可从容地进行分离和测定。利用微透析技术进行动物实验主要是在被限制动物或麻醉动物身上，也可用于自由活动的清醒动物，应用最多的脑功能的研究，近年来该技术的应用已取得很多的科研成果。脑：在颅内手术，Hutchinson 等利用微透析方法与其他监测手段研究动脉瘤手术的情况,得出:患者

8、稳定期脑氧压 2.06.0kPa(1545 mmHg)之间；葡萄糖含微透析技术2014/5/18 3量在 0.53 mmol/L 之间,乳酸/丙酮酸比值30，在 3265 之间则暗示有厌氧代谢,3 min的短暂夹闭不会引起脑氧量减少或乳酸/葡萄糖比值的升高；长时间夹闭则会有副作用。万登峰等应用微透析技术动态收集大鼠轻、重度脑损伤局部的细胞外液(ECF)透析液,观察其葡萄糖含量(Glud)和乳酸含量(Lacd)变化。透析管插入引起Glud 和 Lacd 的变化很小(P0.05)；脑损伤后Glud 下降，与对照组及损伤前相比相差显著(P0.05)，且损伤越重其变化越显著(P0.05)；而脑损伤后L

9、acd 则上升，与对照组及损伤前相比相差显著(P0.05)，且损伤越重其变化亦越显著(P0.05)；脑损伤后Glud 和 Lacd 的变化分别与脑组织含水量呈显著负相关(P0.05)和显著正相关(P0.05)。皮肤：Sjogren 等选用聚乙烯砜膜(100 kD) 探针测定皮肤在探针插入这一微创条件下白介素- 6 的产生,为测定复杂的细胞因子系统提供了技术参考。金属离子与一些皮肤病的发病有关,但活体皮肤离子浓度测定一直较难实施,Leveque 等以该技术联用原子吸收光度计测定真皮铁离子浓度,证实微透析可用于皮肤离子测定。此外还可进行血液、脂肪、肌肉中药物浓度的变化。由于物质跨膜扩散是双向性的，

10、微透析技术除了可用于监测体内环境的生化改变外,还可作为一种给药途径。可将药物缓慢、直接地作用于靶器官，提高药效分析和药物代谢动力学研究的水平，特别是局部直接给药更能显示出这种方法的优越性。阳晓等研究发现，在实验性大鼠的腹透液中加入川芎嗪长期进行腹膜透析(PD)，腹膜间皮细胞结构基本完好,间皮下无明显的基质沉积，且大鼠 PD 的超滤量显著提高，小分子物质的清除率增加,而对透出液中蛋白质浓度则无明显影响。微透析技术已用于测定直接人脑实质的药物浓度，并可帮助诸如爱滋病毒（HIV）感染病人选择合适的穿透血脑屏障的药物。但微透析技术仍存在一些不足，微透析技术的不足之处在于探针的植入会造成局部轻微的损伤。

11、特别是对急性实验可能有一定程度的影响。回收率的测定虽然种类繁多, 但每种方法都不够完善, 影响了实际浓度的计算。由于采用的方法不同在检测浓度极低的生理活性物质时不同作者的报告有时可能相差近一个数量级。微透析技术要求探头必须准确插在同一取样部位, 因此不适合对很小的脑内神经核团采样。由于透析膜体积小, 灌流液的流速低(一般 1 5 l/min),很难进行以秒为单位的动态观察。二、微透析技术在脑组织研究中的应用微透析技术是将推挽灌流和透析技术结合起来并逐渐完善的一种新型生物采样技术,可在麻醉或清醒的生物体上使用,特别适合于深部组织和重要器官的活体生化研究。微透析技术最早应用于脑内是在 1972 年

12、美国耶鲁大学报道的猴脑的微透析研究，之后微透析即开始应用于对脑内神经递质的改变，药物动力学监测以及一些疾病脑内神经生理改变的研究，至今已有 30 多年的历史。本文就微透析技术在脑组织研究中的应用作一综述。1、微透析技术的原理及探针回收率的测定微透析技术2014/5/18 4微透析技术是以透析原理作为基础的在体取样技术，是在非平衡条件下即流出的透析液中待测化合物的浓度低于它在探针膜周围样品基质中的浓度，灌注埋在组织中的微透析探针，组织中的待测化合物沿浓度梯度扩散进入透析液，被连续不断地带出，从而达到从活体组织中取样的目的，通过测定流出液即透析液中待测物的浓度来研究组织中待测物的水平。这是一种动态

13、连续的取样方法。简单地说，微透析技术的原理就相当于在组织中创造了一个“毛细血管”，使化合物在浓度差的作用下扩散而进入此“毛细血管”，然后随液体流动带出体外进行检测。微透析技术最大的优点是可在基本上不干扰体内正常生理过程的情况下进行在体、实时和在线取样,透析过程探针周围的组织液成分不会发生改变，所以可以持续收集样品，而且被透析动物可以小到老鼠一般大小。通过微透析技术可以单独取得细胞外液,因此可对大脑神经递质进行活体监测，由于透析液中不含蛋白质和酶等生物大分子，能直接进样进行高效液相和毛细管电泳等生化分析，免除了复杂的进样前样品处理及由此而产生的样品损失和误差，也不会因在室温取样而酶解，提高了样品

14、的稳定性，而且随着现代技术的进步可以对微透析试验进行全程的自动化控制。微透析试验中一个重要的步骤是要测定微透析探针的回收率(透析液中待测化合物的浓度与其在样品基质中浓度之比)，由于微透析是在非平衡条件下取样，所以所测得的透析液中化合物的浓度只是探针周围样品基质中该化合物浓度的一部分。在了解该化合物待测部位的实际浓度时必须测定探针的回收率，它是影响微透析结果的重要因素，并取决于取样部位的生物学性质、透析膜的物理性质(材料，孔径，长度，几何形状等)、待测物质的分子量、灌流速度、压力、生物体本身的健康条件和生物节律等。探针回收率有体内、体外之分，体外的测定方法比较简单，配制被测物质的标准溶液进行透析

15、，测定透析液中该物质的浓度，再与标准溶液浓度进行比较即可得出。体内的测定则较复杂，常用的体内测定方法零净通量法，该法是将灌流液流速控制恒定,分别测定不同浓度的灌流液达到稳态后透析液中分析物的浓度。当灌流液中分析物的浓度低于探针外介质时，扩散方向就是从介质到探针；反之，即是从探针到介质。零通量点时，探针内外浓度相等。绘制灌流液不同浓度与透析液中分析物浓度的直线回归图，这时斜率即为探针回收率。此法是一种带有尝试性的方法，需要对分析物在体内的浓度范围有一定的了解。反透析法是用一种内标物加入到灌流液中进行透析，通过测定透析液中内标物的浓度，与灌流液浓度做对比，用 1 减去该比值即为该物质的体内回收率。

16、这种内标物要求具有惰性，不与体内物质反应且又尽可能与待测物结构性质相近。该法优点在于可真实反映体内回收率的变化情况。低速灌流法，在灌流速度约为 50nL/min 时进行灌流，一般相对回收率可达 90%。这种方法的缺点是显而易见的，不但在样本采集时耗时，且在灌流过程中样品挥发程度也很严重。在只需要知道被测物质的相对浓度变化时，可简单的测定探针的体外回收率，测定应在透析前进行，配制被测物质的标准溶液(浓度要与该物质在体内的浓度相似)，用与体内试验相同的灌流速度灌流探针，达到稳定状态后收集透析液并进行检测，测定浓度与标准液浓度之比就是探针的体外回收率。此法虽简单易行，但由于被测物质在体内、外的状况不

17、同，检测结果不能严格的等同于体内回收率。2、 微透析系统的组成及脑内微透析的操作步骤 目前国际上生产微透析系统的公司主要有：瑞典 CMA 公司，美国 BAS 公司，以及日本的 EICOM 公司，我们使用的是美国 BAS 公司的产品。中国科学院北京化学研究所，中国科微透析技术2014/5/18 5学院上海生物研究所，天津神经外科研究所都较早地开展了微透析技术，而且可以自行设计微透析探针并申请了国家专利。微透析系统主要有：微量灌注泵，与微量灌注泵相配套的微量注射器，连接管，微透析探针，与探针相配套的微透析套管以及微透析分段收集仪。另外在透析清醒大鼠时还需要一套光感应收集笼以保证大鼠在透析过程中可以

18、自由活动而不影响透析过程。其中最关键的部分是微透析探针，它是由导入管,导出管,中空纤维管,半透膜组成。BAS 公司有 3 种不同设计风格的探针(针式、直线型、分流型)。该公司提供的可选择探针有脑探针,主要用于脑组织及脊髓组织的透析；联合灌注脑探针主要用于脑组织，可以同时进行透析和灌注；脉管探针主要用于血管、肌肉、皮下组织、腹膜等组织部位的透析；线型探针主要用于真皮、肌肉、肝脏、胰腺、肾脏等部位的透析；环型探针主要用于皮下组织,分流型探针主要用于检测胆汁成分的变化。另外依据探针的形状又可将其分为 U 型、I 型、线性和环形探针，其中 U 型、I 型探针由于其体积小，对脑组织损伤小常用于脑内微透析

19、，而线型、环型探针的使用同上所述。每种探针都有几种不同长度的半透膜供选择。试验中探针的选择主要依据所透析的部位以及靶组织的尺寸，不必完全拘泥于探针的设计风格。对于脑内的透析试验，为防止探针膜的损伤，在试验前应先在麻醉状态下，给大鼠脑部植入微透析探针引导管,依照大鼠脑立体定位图谱，借助立体定位仪找到目标部位植入微透析探针引导管，手术后 34d 大鼠恢复自由活动后开始对其进行透析，试验时先将微透析系统连接好，冲洗探针(探针膜被甘油封存着，使用前应先将其冲洗掉)，探针准备好后，拔出大鼠脑部引导管内芯将微透析探针插入，用微灌注泵通过探针的进液管，向探针内以恒定的速度灌流与脑组织液成分相似的等渗灌流液，

20、此时膜外小分子物质将顺浓度梯度进入灌流液中，并随灌流液通过探针的导出管被引流出来，调整分段收集仪,一定时间段收集一次液体(BAS 公司分段收集仪可直接在 04环境中收集液体，有效避免了样品在空气中的降解)，由于透析过程中大分子量物质不能通过透析膜，收集到的液体可以直接注入高效液相色谱仪或毛细血管电泳仪进行定量检测。3、微透析技术在脑组织中的应用脑内微透析技术是刚刚发展起来的一种在体研究脑内神经递质活动的方法，微透析技术结合高灵敏度的微量化学分析技术可以精确测定脑内特定脑区神经递质的变化情况。利用微透析技术进行动物试验，主要是在被限制动物或在麻醉动物身上，也可以用在自由活动的清醒动物(需要设计能

21、供动物自由活动的光感应笼)。Bagger 等,将微透析技术应用于经鼻黏膜给药后药物在脑内代谢过程的研究，探讨了药物经嗅觉区吸收的模型。邓小明等利用微透析技术对大鼠脑缺血再灌注损伤进行研究，认为谷氨酸(Glu)与天门冬氨酸(Asp)等兴奋性氨基酸在缺血性神经细胞损伤中起关键作用，缺血时间越长脑间质 Glu 与Asp 的峰值浓度就越高，神经病理学和神经学损伤也就越严重。在老年医学的研究中，中国科学院上海生理研究所利用微透析技术对老龄大鼠和年轻大鼠皮层胆碱能神经系统的功能进行活体监测，检测出老龄大鼠皮层乙酰胆碱(Ach)的基础水平显著低于年轻清醒大鼠皮层 Ach 的基础水平,为进一步探讨老龄大鼠与年

22、轻大鼠学习记忆方面差别的机理提供了证据。脑内微透析技术已经成为研究各种动物模型脑内神经递质变化不可缺少的方法，国内众多实验室都在逐渐开展微透析技术，以便更清晰准确地反映一定条件下脑内神经递质的变化情况。脑内微透析技术近几年在临床也有较多应用，Hutchinson 等利用微透析技术与其它监微透析技术2014/5/18 6测手段研究动脉瘤手术的情况得出：患者稳定期脑氧压在 1545mmHg 之间，葡萄糖含量在(0.53)mmol/L 之间，乳酸/丙酮酸比值大于 30，则提示有厌氧代谢的可能；小于 3min 的短暂动脉夹闭不会引起脑氧量减少或乳酸/葡萄糖比值的升高，长时间夹闭则会有副作用。有研究，微

23、透析能在患者脑缺血局部脑氧分压和脑血流量出现变化后 530min 即发现代谢物的变化，早于临床症状，为临床治疗提供了更大的空间。在国外微透析技术和设备已经逐渐标准化，被作为一种常规方法应用于神经外科手术和神经内科疾病的监护治疗，并能提供正常参考值来评价患者透析期间的变化，大大降低了患者的死亡率。目前微透析技术应用于临床的疾病主要涉及颅脑损伤，蛛网膜下隙出血，癫，帕金森氏病，脑肿瘤等，但国内有关脑内微透析技术应用于临床的报道还很少。4、结语脑内微透析技术为研究脑内的递质改变，损伤变化以及药动学监测提供了有效手段，但该技术仍存在一些缺陷：植入套管手术对脑的刺激，相对回收率较低，透析量微少对检测手段提出很大挑战，而且由于微透析收集的透析液量在一定时间内受到限制，每个时间点收集的透析液量一般仅可用于 12 次高效液相的测定，意味着一般只能得到 12 种生物活性物质的信息，如果一次进样能够得到多种物质信息将大大节约成本和时间而且提高研究水平。同时国内微透析设备主要还是依靠进口，高质量微透析探针的国产化，是推动该技术发展的主要动力。微透析技术在脑内的科学研究已显示出其巨大的生命力，相信其会得到更快更好的发展。