1、1亲和层析法纯化胰蛋白酶实验一 鸡卵蛋白的提取50 毫克鸡卵清于 250 毫升烧杯中搅拌且缓加等体积 10%TCA 溶液稳定PH 在 3.50.2，放入 4C 冰箱过夜沉淀转移到 50 毫升离心杯中，3000rpm 离心 15min转移鸡卵蛋白与 50 毫升离心杯中，3000rpm 离心 15min,收集上清液收集上清液，滤纸过滤弃去上清液弃去沉淀沉淀离心杯与真空干燥器中，抽去残留丙酮。 （沉淀变为透明胶状物）滤液用 1mol/L 盐酸在 PH 计下调 PH 至 3.5加入 25 毫升蒸馏水或 20mmol/L，PH 6.5 磷酸缓冲液溶解。滤纸过滤吸出上清液弃去上浮脂类物质和不溶物加三倍体积
2、预冷丙酮，搅拌，塑料膜封口，冰箱 4 摄氏度静止 4h滤液收集备用 弃去沉淀将鸡卵蛋白滤液先经 Sephadex G-25 分离纯化，再由 DEAE-Cellulose 离子交换层析柱分离收集鸡卵蛋白分离液转入透析袋，以蒸馏水透析，常换水，直到渗出液颈硝酸银检验无氯离子透析的鸡卵蛋白液以 0.1mol/L 盐酸调 PH4.0，量体积加三倍体积预冷丙酮，搅拌，塑料膜封口，冰箱静止 4h 或过夜弃去上清液沉淀转移到 50 毫升离心杯中，3000rpm 离心 15min收集沉淀，鸡卵蛋白离心杯于真空干燥器中干燥，手机成品，冰箱保存2实验二 胰蛋白酶粗提取50 克猪胰脏，去除结缔组织及脂肪，净重 30
3、 克左右，剪成碎块转移到组织器中，加 150 毫升预冷的 3.5%乙酸酸化水，均浆转移到 500 毫升烧杯，2mol/L 硫酸调节 PH3.5-4.0,10 摄氏度搅拌提取4h纱布四层水湿润后于玻璃漏斗上，胰蛋白酶原提取过滤弃去滤渣收集滤液，以 2mol/L 硫酸调节绿叶 PH2.5-3.0 之间，4 摄氏度冰箱静止沉淀 4 小时以上折叠纸过滤弃去滤渣收集滤液，以 5mol/L 氢氧化钠调 PH为 8.0，量取溶液体积加入固体氯化钙是钙离子终浓度为 0.1mol/L，加入约 5mg 结晶胰蛋白酶，混匀，激活34 摄氏度冰箱激活 12-16h，在 25 摄氏度很稳水域中激活 2-4h取 1ml
4、上清液测定蛋白浓度和活性等酶溶液的比活性达到 1000u/mg 时没用 2mol/L 硫酸调节 PH3.0滤纸过滤滤除硫酸钙沉淀 收集滤液，4 摄氏度保存4实验三 亲和色谱分离胰蛋白酶琼脂糖凝胶层析介质的处理：称取 10 克琼脂糖凝胶层析介质，置于 G-3 玻璃烧结漏斗内用 100ml 1.0mol/L NaCl 溶液抽洗（少量多次） ，100ml 蒸馏水抽洗，抽干后转移到100ml 三角瓶中备用向盛有介质的三角瓶中加入蒸馏水 7ml，1,4 二氧六环 8 ml，2 mol/L NaOH 6.5ml，环氧氯丙烷 1.5ml，放入 45恒温摇床中，于 160 转/分钟，振摇活化 2 小时停止活化
5、，转移到 G-3 玻璃烧结漏斗内，抽去活化剂，用 100ml 蒸馏水洗（少量多次） ，转移 100ml 到三角瓶中，准备偶联称取约 100mg 鸡卵粘蛋白，用 10ml 0.1mol/L pH9.5 Na2CO3 缓冲液充分溶解取 0.1ml 稀释 10 倍测定 OD280，计算溶液的蛋白浓度将溶解好的鸡卵粘蛋白溶液，转移到 100ml 三角瓶中与活化的琼脂糖凝胶介质混匀在 40恒温摇床中，于 160 转/ 分钟，振摇偶联 22 小时左右，停止偶联5取一个洗净的 500ml 抽滤瓶，将已经偶联好的琼脂糖凝胶层析介质转移到 G-3 玻璃烧结漏斗内抽滤，收集滤液，测定滤液中剩余的鸡卵粘蛋白的含量用
6、 100ml 1.0mol/L NaCl 溶液抽洗，100ml 蒸馏水抽洗，再用20ml 亲和层析洗脱液洗涤将亲和介质转移到 50ml 的小烧杯内，加入 20ml 亲和层析平衡液，浸泡 20 分钟，脱气，装柱装柱：取一支层析柱(101.0cm),将合成好的亲和层析介质 CHOM-Sepharose 4B 装入柱内,自然沉降以 0.1molL，pH 8.0Tris-HCl 缓冲液平衡将已激活的胰蛋白酶提取液用 5 molL NaOH 精确调节 pH 至 pH 8.0滤纸过滤取滤液上样以 0.1molL，pH 8.0Tris-HCl 缓冲液平衡洗去未被吸附的杂蛋白6等平衡到基线稳定后，用 0.1molL，pH2.5 甲酸-0.5molL KCl 溶液洗脱收集洗脱峰测定纯胰蛋白酶浓度、活性 放入层析袋内，在 4C 对蒸馏水透析冻干燥成干粉
