超高效液相色谱法测定柑橘果肉中四种植物性内源激素的含量.doc

1、 超高效液相色谱法测定柑橘果肉中四种植物性内源激素的含量摘要：利用超高效液相色谱法同时测定柑橘（citrus reticulate bance）果肉中的玉米素、赤霉素、吲哚乙酸和脱落酸的含量。以色谱柱，甲醇冰乙酸为流动相梯度洗脱，检测波长为 ，流速 。结果表明， 玉米素含量在 间线性关系良好，为 ，平均回收率为，为 ；赤霉素含量在 间线性关系良好，为 ，平均回收率为 ，为；吲哚乙酸含量在 间线性关系良好，为 ，平均回收率为 ，为；脱落酸含量在 间线性关系良好，为 ，平均回收率为 ，为。该方法简便、快速、精密度高、准确性好，可用于植物样品中激素含量的测定。关键词：柑橘（citrus reticu

2、late bance） ；植物激素；超高效液相色谱法 ， ， ， （ ， ， ）： （） ， （） ， （） （） was proceeded ， ， zt and ， ， ， and ， ， ， iaa and ， ， ， ， ， ， ， ， ould ： （citrus reticulate bance） ； ； 植物性内源激素是植物体内合成的对植物生长发育有显著作用的微量有机物，其生理效应复杂多样，对植物生长发育有重要的调节控制作用， 。吲哚乙酸、赤霉素、脱落酸、玉米素是植物体广泛存在的植物激素，本研究运用超高效液相色谱（）法同时测定柑橘中这种内源激素，利用超高分离度、快速、超高灵敏度的

3、优点，解决传统在植物激素分析中存在的分离度差，分析时间较长的缺点。本研究建立了植物内源激素高效、稳定、准确的分离和测定方法，为植物内源激素调节其营养生理与生长的研究提供支撑。吲哚乙酸（）是一种植物体内普遍存在的含有一个不饱和芳香族环和一个乙酸侧链的内源激素，属吲哚类化合物，又名生长素，其基本作用在于调节植物生长；赤霉素（）是一类属于双萜类化合物的植物激素，典型生理作用是能促进枝条的生长，尤其是能促进无伤害植物的整体生长；脱落酸（）是一种具有倍半萜结构的抑制生长的植物激素，因能促使叶子脱落而得名，具有加速植物器官脱落，抑制整株植物或离体器官的生长，并对细胞的分裂与生长起抑制等作用；玉米素（）是一

4、种天然的细胞分裂素，化学名称为（羟基甲基反丁烯基）氨基嘌呤，它是从甜玉米灌浆期的子粒中提取并结晶出的第一个天然细胞分裂素，能刺激植物细胞分裂，促进叶绿素形成，加速植物新陈代谢和蛋白质的合成，从而达到有机体迅速增长，促使作物早熟丰产，提高植物抗病抗衰抗寒能力。 材料与方法 仪器和试剂 超高效液相色谱系统，色谱工作站，检测器： 紫外检测器（公司） ；台式系列数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司） 。玉米素标准品（公司，纯度） ；赤霉素标准品（公司，纯度） ；吲哚乙酸（ 公司，纯度） ；脱落酸（公司，纯度） ；甲醇（色谱纯） ；冰乙酸（分析纯） ；超纯水；柱（ ，美国赛分科技公司） 。 实验方法

5、 样品采集 实验所用的柑橘样品均采自广西全州。在不同时间共采集组样品。摘取生长中的柑橘果实，迅速放入冰盒中带回实验室，保存备用。 色谱条件 色谱柱： ， （ ） ；流动相：甲醇冰乙酸梯度洗脱；流速 ；检测波长为 ；柱温为 。 标准溶液的制备 分别精密称取玉米素、赤霉素、吲哚乙酸、脱落酸标准对照品、 置于 容量瓶中，甲醇溶解定容，配制浓度分别为、 的标准储备溶液。 样品溶液的制备 称取已匀浆的柑橘果肉 置于 容量瓶中，用甲醇溶解，冰水浴超声 ，取出恢复常温后，甲醇定容，过滤，取过滤液 于 分度比色管，氮吹去除甲醇，残留液于柱中脱色，用 流动相分次洗脱，用 分度比色管收集所有从柱的流出液，流动相定

6、容至 ，用 有机滤膜过滤，滤液即为待测液。 四种植物激素混合标准曲线的制备 分别吸取玉米素、赤霉素、吲哚乙酸及脱落酸标准储备溶液、 于个 容量瓶中，流动相定容至刻度，依次进样，进样体积为 。 结果与分析 提取方法的确定据文献报道，玉米素、赤霉素、吲哚乙酸和脱落酸种激素可采用的丙酮水溶液 、 溶液 、甲醇水溶液等溶剂提取，石油醚、乙酸乙酯、和柱等方式净化，根据种激素对时间和热不稳定 ，易发生降解反应，所以在实验操作过程中应注意控制时间及温度，本试验通过对不同的提取溶剂，提取方式（超声提取、过夜浸提） 、提取时间、提取次数分别做单因素考察实验，最终确定以甲醇为提取剂，冰水浴超声提取 ，柱净化为最佳

7、实验条件。 色谱条件的选择 色谱柱的选择 植物样品中含杂质量较多，分离难度较大。选用粒径低于 的小颗粒作为填料，比普通有更高的分离度、灵敏度和分析速度，因此对分离测定植物样品中的种激素具有较大的优势。本实验选用 （ ） 、 （ ）和 （ ）分别对样品进行分离测定，结果显示用 （ ）能够对样品进行很好的分离。 波长的选择 将种激素的混合标准溶液于超高效液相色谱系统上进行测定，紫外检测器对其进行光谱扫描，最大吸收光谱的波长分别为：玉米素（）在 和 有吸收峰，赤霉素（）在 和 有吸收峰，吲哚乙酸（）在 和 有吸收峰，脱落酸（）在 和 有吸收峰。将种激素的混合标准液分别在以上多个波长下进行测定，发现在

8、波长为 下标准混合液出峰基线毛刺少且峰形较好，玉米素、吲哚乙酸和脱落酸的峰面积为最高，赤霉素峰面积也变化较少，所以本实验采用 为种激素的检测波长。种激素的吸收光谱图见图。 流动相的选择 根据种激素的特性及植物样品所含的杂质量，通过对各种流动相如甲醇水、乙腈水、甲醇乙酸水、乙腈乙酸水等不同溶液系统的尝试，最终选用甲醇和冰乙酸水溶液为流动相。经反复试验后，发现甲醇和冰乙酸水溶液在梯度洗脱的条件下，各组分分离较好，且各峰峰型较好，分析时间也较短。种激素保留时间合适，色谱图见图；流动相比例见表。 线性关系以对照品进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，将所得数据绘成标准曲线，玉米素线性方程为：，= ，线性范围

9、 ；赤霉素线性方程为：，= ，线性范围 ；吲哚乙酸线性方程为：，= ，线性范围 ；脱落酸线性方程为： ，= ，线性范围 。结果见图图。 精密度试验精密吸取玉米素、赤霉素、脱落酸和吲哚乙酸混合标准溶液各 ，重复进样次，测定峰面积，玉米素、赤霉素、吲哚乙酸和脱落酸标准溶液峰面积的分别为、。表明方法精密度良好。 重复性试验同一批柑橘样品取样份，按操作，依法测定，计算玉米素、赤霉素、吲哚乙酸和脱落酸的含量，分别为、。表明方法重复性良好。 回收率试验称取已知含量的样品份，加入玉米素、赤霉素、吲哚乙酸和脱落酸标准溶液、 各份，按进行操作测定，计算回收率，结果（表-表）表明，回收率在，在，表明方法回收率较好。 样品测定结果对柑橘样品进行分析，每批样品重复测定次，结果取平均值，结果见表。 小结与讨论以甲醇为提取剂，冰水浴超声提取 ，柱净化为最佳实验条件，甲醇和冰乙酸为流动相，流速 梯度洗脱，系统对样品进行测定，样品中种激素能在 之内达到较好的分离。充分利用了超高效液相色谱的优点与有利条件，建立的方法简单可靠，进一步拓宽了液相色谱在植物激素测定方面的应用。参考文献： 刘贤明，梁锦添，秦绪雄用高效液相色谱分析植物内源激素吲哚乙酸、脱落酸和玉米素 色谱，（）： 陈小鹏，王秀峰，孙小镭，等高效液相色谱测定黄瓜瓜条中赤霉素和脱落酸含量 山东农业科学，（）：