高尔基体中糖基转移酶的信号介导的动态保留.doc

1、高尔基体中糖基转移酶的信号介导的动态保留Linna Tu, William C. S. Tai,* Lu Chen, David K. Banfield高尔基的糖基转移酶是一种酶家族的有序的修改糖蛋白的具体方式蛋白。第二类组成，这些膜蛋白的特点是短期暴露细胞质氨基末端尾巴和一腔酶域。细胞质尾巴发挥本地化的糖基转移酶的作用，外壳蛋白复合物COPI泡介导的逆行运输也在高尔基内工作。然而，这些酶缺乏的尾巴能识别COPI序列。在这里，我们发现Vps74p 绑定到在多数的酵母细胞质尾巴五聚体主题目前高尔基本地化的糖基转移酶，以及COPI。我们建议Vps74p保持稳定，高尔基州的糖基转移酶动态定位到COP

2、I通过促进其纳入小泡。 在高尔基体的功能，作为新合成的蛋白质分拣中心和作为糖蛋白的翻译后修饰的位置。蛋白糖基化是发起的内质网（ER） 。 糖蛋白，然后经过由高尔基组本地化广泛的顺序糖基转移酶糖链伸长和阐述介导的。虽然他们独特的催化糖基化反应，并显示脑池的分布特点，高尔基居民糖基转移酶都是II型膜蛋白组成的短期暴露细胞质N末端（尾）组成一个单独得薄膜区，一个导向主干区域和催化结构域的腔。Avariety 的功能已确定了影响这些酶（ 1-3）：在跨膜区（4-8 ） ，特定区的腔面向非催化区（6,8） ，催化域之间的相互作用（9 ，10 ）和细胞质 尾（11-13） 。稳态这些酶的分布状态维持一个动

3、态的过程，它涉及到从晚期高尔基到早期生理池的检索，以及与高尔基和内质网，于是他们过境回到池对它们的功能（14，15 ） 。虽然糖基转移酶的功能，直接的一个特定的酶一池或另一稳态变化，大概外壳蛋白复合物（COPI） ，小泡是由其中这些酶大部分被回收（14，16 的主要手段） 。然而，高尔基居民糖基转移酶缺乏规范 COPI在其细胞质尾巴结合基序，我们设法查明的蛋白质，可以结合 这些酶的尾巴，COPI可以促进其纳入小泡。我们确定了一个基本与高尔基删除相关的杀伤力居民圈套遗传屏幕前部抑制 Vps74p（水溶性 N -乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体） ，Sft1p，高尔基内的（17）逆行运输所需的一

4、种蛋白质。 Vps74p 是一个蛋白质家族，其中包括哺乳动物蛋白 GPP34（GmX33a ）和 GPP34R（GmX33b） （18-21）的成员。虽然 VPS74 删除了对酵母细胞生长无明显影响，vps74D 细胞已知非分类的羧肽酶 Y，这说明 Vps74p 参与蛋白质的运输（22） 。我们注意到，vps74D 缺陷细胞中的糖基（GPI）的处理锚定蛋白 Gas1p。 Gas1p 是修改增加了 N -和 O -连接碳水化合物，因为它穿越途中的高尔基体与细胞表面（图1A） （ 23） 。在酵母中的 Gas1p 缺乏 N 中所涉及的酶菌株命运的比较和Oglycosylation 揭示了在缺乏的

5、A1 ,2 - mannosyltransferase，Kre2p（图1，A 和 B） （24）细胞类似的加工缺陷。我们考虑到 Vps74p 可能需要 Gas1p运输和审查功能 Gas1p 贩运单体的可能性 ，红色荧光蛋白（ Gas1p - mRFP）融合蛋白在细胞缺乏 Vps74p（25） 。然而，Gas1p 位置在 vps74D 细胞 mRFP是无法区别的，在野生型细胞（图 1c） 。 像 GPP34（18） ，Vps74p 是一个外周膜蛋白（图 1，D 和 E） ，因此，只会有能力直接的物理与细胞质相互作用面向 N 端 11 个氨基酸的 Kre2p。我们建造了一个混合体，其中蛋白质的 K

6、re2p 的细胞质和跨膜区域融合到 N -端mRFP 结束（Kre2CT - mRFP） 。在野生型细胞，Kre2CT - mRFP 是局部的无数小点在整个细胞质中，这部分的重叠，绿色荧光蛋白（GFP）融合到高尔基体，居民蛋白质，Rer1p （绿色荧光蛋白- Rer1p） （图 1 楼） 。此外，由于不Rer1p（26 ）和 Mnn9p 糖基转移酶复合物（ 16） ，高尔基体和内质网之间的Kre2CT -绿色荧光蛋白循环通过 COPI建立依赖机制（图中一） 。在 vps74D 细胞，但是，Kre2CT - mRFP 是定位于液泡（图 1） 。这种效果是不是因为在高尔基保留一般不足驻地膜蛋白，因

7、为绿色荧光蛋白本地化 Rer1p 到高尔基没有受到影响。这些调查结果是一致的为 Vps74p 的 Kre2p 在高尔基体的动态保存的作用，并确定了 N -端 11 个氨基酸的蛋白质为保留足够的调解。 酵母基因中，尤其是在糖基化涉及被删除细胞显示减少了在场的可行性calcofluor 白（连续） 。细胞缺乏 VPS74 更为敏感，连续超过 kre2D 细胞（图中二） ，所以我们推断，Vps74p 调解可能增加糖基转移酶的高尔基本地化。当VPS74 从表达 Mnn9 -绿色荧光蛋白，Mnn2 -绿色荧光蛋白，或 Ktr6CTGFP 菌株删除，这些蛋白的确非局部化，要么一泡状烟雾（Mnn9 - GF

8、P）的，或对液泡（Mnn2 内腔 - GFP 和 Ktr6CTGFP） （图 2A）条。对齐的 N 端 对酵母糖基转移酶家族成员细胞质尾巴暴露了一个 semiconserved motif (F/L)-(L/V)-(S/T)（27）在 对家庭的一些成员的（表 1）细胞质尾巴。我们取代 Phe4 丙氨酸 Leu5 - Ser6（滑膜）在 Kre2p 和评估的命运 关于本地化的 kre2 这些替换（AAA6）的 CT -绿色荧光蛋白，以及对突变全长蛋白的能力，kre2（AAA6） ，来处理 Gas1p 在 kre2D 细胞。 kre2（AAA6）的 CT -绿色荧光蛋白是非局部化对在野生型细胞（图

9、 2B 条液泡内部） ，和细胞表达他们对酶的唯一来源kre2（AAA6）来自缺乏 KRE2 基因在细胞的功能相同的不能完全处理Gas1p（图 2C 型） 。我们建议，在 Gas1p 加工缺陷有关的图的不稳定。 1。 Vps74p 是需要 Kre2p 在高尔基保留。 （甲）的位置 和顺序的糖基转移酶在Gas1p 参与行动 加工（29 ） 。 （乙）vps74D 细胞缺陷类似 Gas1p 处理 缺陷缺乏 Kre2p 细胞。相对位置完全处理，糖化 Gas1p（mGas1p）和急诊室驻留Gas1p 前体形式 （pGas1p ）的说明。 （c）运输的 Gas1p - mRFP 到细胞表面，在 vps74

10、D 细胞不受影响。比例尺，5 毫米。 （四）Vps74p 结合膜。全细胞提取物（WCEs）遭到了离心连续弹一点三零零万克（13K）和 10 万克（10 万）和颗粒（P）和上清液（ S）的受 SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE 电泳）和染色。 （五） Vps74p 是一个外周膜蛋白。酵母 WCEs 提取裂解液与单（磅）或 1海卫 X100（Tx100 ） ，0.1M 的碳酸钠 pH 值 11.5（pH值） ，或 1 M 氯化钠（盐）在裂解液。 （六）Kre2CT - mRFP 而不是绿色荧光蛋白，Rer1p 是非局部化在 vps74D 细胞液泡流明。有关的试剂和方法的详细说明使用

11、，见（24） 。 DIC 的，微分干涉对比。 Kre2p 在缺乏 Vps74p 细胞。事实上，Kre2p 明显减少丰富 vps74D 细胞，以及 kre2 丰富的野生型细胞非常相似 vps74D 细胞（图二维）到 Kre2p 的（AAA6） 。此外，Gas1p 处理 kre2D细胞表达 N -末端 Kre2p 杂交产生的蛋白质含有类似图案滑膜糖基转移酶 同Anp1 异常（表 1）是从野生型细胞（图 3a 区分） 。进一步的证据表明，类似主题的财务和后勤系统是很重要的识别获得由 Vps74p 从酵母双杂交实验，其中野生型或滑膜丙氨酸取代胞质尾的 Kre2p kre2C3（AAA6） 是用来评估V

12、ps74p 约束力。虽然 Vps74p 是能够绑定到野生型的 Kre2p 胞质尾序列，发现没有互动和 kre2C3 之间 Vps74p（AAA6） （图 3B）款。 Vps74p 直接绑定的 Kre2p 胞质尾，和 FLS 主题替换减少约束力 （图 3C 和图。三） 。 该 Anp1-Kre2混合蛋白恢复 Gas1p 加工 kre2D 细胞（图 3a）的无力令人费解，因此我们认为有可能承认的 Vps74p glycosyltransferas 中，除了滑膜样主题。最近的一项研究表明，一个在 Mnn9p 回收二元序列从高尔基重要作用，内质网（13） ，和我们的酵母双杂交化验， Kre2p 稳定性

13、研究和活细胞成像实验的支持，为 KR8 肽要求在 Vps74 的 Kre2p（图四）依赖保留。此外，我们发现没有滑膜样内残留的要求极样 Kre2p 主题，而 F4 和 L5，是必不可少的结合 Vps74p（图五） 。因此，Vps74p 关于酵母高尔基体结合位点，符合居民的糖基转移酶的(F/L)-(L/I/V)-X-X-(R/K)的一个主题是在 16 高尔基居民酶的存在（见表 1） 。为了测试这项建议的有效性，我们研究了 Mnn5 命运绿色荧光蛋白，其中包含一个序列，符合共识（LIXXK6）在 vps74D 细胞。与我们的预测，Mnn5 -绿色荧光蛋白相一致的是非局部化在这些细胞中（图六）液泡流

14、明。 Vps74p 可以促进或阻止从高尔基这些酶顺贩运或协助其通过高尔基回收池或从高尔基体到急诊室，在这个过程通过 COPI大衣（图中一）糖基转移酶介导高尔基保留。为了区分这些可能性，我们研究了 Kre2CT 命运绿色荧光蛋白在细胞中的组成性高表达 Vps74p。我们推断，如果 Vps74p 运作在急诊室回收途径，表达的蛋白质可能将转向稳定的 Kre2CT 态分布，从高尔基体到内质网绿色荧光蛋白。这确实是如此; VPS74 表达了对稳定的 Kre2CT 国家定位的影响，绿色荧光蛋白是不是因为在急诊室块或间接出口到逆行运输一般加速度（图三维） 。 Vps74p -绿色荧光蛋白在 Kre2CT 的

15、逆行运输作用也得到了我们的基因研究。除了 VPS74，我们还发现基因编码的高尔基囊泡大衣复杂 COPI或基板（图七）组件。由于 Sft1p 是在高尔基（ 17）逆行运输需要，我们推测，作此 sft1D 细胞缺乏这些基因表达的补偿。此外，观察基因之间的相互作用和 VPS74 缺陷突变体在 ER -高尔基贩卖（图七） 。 鉴于 Mnn9p 复杂（16 ）和 Kre2CT -绿色荧光蛋白（图中一）周期的电脑操作员之间的高尔基体和 ER -依赖性，我们认为有可能 Vps74p 可能功能的电脑操作员共同调解回收图 2。VPS74 的删除导致非局部化和高尔基一个子集 糖基转移酶的降解。 （甲）Mnn2 -

16、绿色荧光蛋白， Mnn9 -绿色荧光蛋白，并Ktr6CT -绿色荧光蛋白是 vps74D 细胞的非局部化。 （乙）氨基酸的替换在Kre2 胞质尾 FLS6 序列kre2（AAA6）的 CT -绿色荧光蛋白 结果的蛋白质非局部化。 （A 和 B）比例尺，5 毫米。 （丙）细胞表达作为其 Kre2p 的唯一来源 kre2（AAA6）有缺陷的 Gas1p 处理。 （丁） kre2（AAA6 ）是不稳定的vps74D 细胞。 （+）或（ - ）表示 h 后内切糖苷。在糖化（糖）和deglycosylated（去糖）的 Kre2p 形式，见箭头。有关的试剂和方法的详细说明使用，见（24） 。WT,野生型

17、。表 1 在酵母细胞质尾巴氨基酸序列高尔基居民糖基转移酶（27） 。滑膜样在突出的斜体字中。糖基转移酶轴承推定 Vps74p 结合，(F/L)(L/I/V)-X-X-(R/K)主题突出显示粗体和他们的相应的主题是强调和斜体字中。 酶氨基酸序列的胞质尾 Kre2 MALFLSKRLLR Ktr1 MAKIMIPASKQPVYKK Ktr2 MQICKVFLTQVKK Ktr3 MSVHHKKKLMPKSALLIRKYQKGIR Ktr4 MRFLSKRILK Ktr5 MLLIRRTINAFLGCIH Ktr6 MHVLLSKKIAR Ktr7 MAIRLNPKVRRFLLDKCRQKR Yur

18、1 MAK Mnt2 MRRKNR Mnt3 MLKSLKSRRLILKR Mnt4 MVLRIRRIKK Mnn1 MLALRRFILNQRSLR Mnn2 MLLTKRFSKLFK Mnn4 MLQRISSKLHRRFLSGLLRVKHYPLRR Mnn5 MLIRLKKRK Mnn9 MSLSLVSYRLRK Anp1 MKYNNRKLSFNPTTVSIAGTLLTVFFLTR Hoc1 MAKTTKRASSFRR Gnt1 MRLISKRRIR Och1 MSRKLSHLIATRKSK 糖基转移酶。与此假说相一致，Sec26p（bCOP ）依赖于 Vps74p 因为它有能力支持 sft

19、1D 细胞生长 （图 S8A） ，并 Vps74p 势必被膜（图 3） ，以及对Sec26p 和 Ret2p（dCOP ）主干地区体外混合实验（图 S8B 和图 3） 。图 3 Vps74p 结合的糖基转移酶的高尔基体和细胞质尾巴被膜。 （一）糖基转移酶- Kre2p 嵌合体轴承滑膜样图案恢复 kre2D 细胞 Gas1p 处理。 （二）在 Kre2p胞质尾 FLS6 序列需要与 Vps74p 相互作用的酵母双杂交法。 AD 和 BD 分别涉及到 GAL4 的活化和结合域。 （三）Vps74p 直接绑定的 Kre2p 胞质尾。 （顶部）免疫印迹 5连接蛋白 ;（中，下）20 的蛋白质的投入。

20、（图）量化的结果（指 标准差） 。一个 kre2C3 融合蛋白（ AAA6）与谷胱甘肽- S -转移kre2C3（ AAA6）GST （26.4 18.6）和 GST（0.1 0.3） 。 （四）VPS74 表达再分配 Kre2CT 从高尔基体到内质网绿色荧光蛋白。指向突出Kre2CT 本地化绿色荧光蛋白。比例尺，5 毫米。 （五）GST-Vps74p 结合被膜从酵母 WCEs。GST-Vps74p 的被膜表面为 7.5 0.4（指 标准差）为最大的GST。 （六）Vps74p 结合标准长度的 GST-Ret2p 和主干网（1 氨基酸 372）GST-Sec26p.（前，左）谷胱甘肽珠纯化培养

21、后，组氨酸 6 标签的 Vps74p 蛋白1 输入。箭头表示的重组蛋白的立场。Vps74p 免疫组织化学染色势必 GST融合蛋白。输入的 Vps74p 与 GST 融合蛋白混合蛋白的相对含量列于 1 和 10 。 （七）GPP34R 在 vps74D 抑制细胞的 Kre2p 不稳定。有关的试剂和方法的详细说明使用，见（24 ） 。 我们建议，Vps74p 的功能是作为高尔基与内质网的运输泡组成部分是COPI表面受体的糖基转移酶分选接收器，这样，控制这些酶的状态的稳定，防止超越高尔基体运输的分布。这个模式的额外支持来自最近的一项研究表明，对 Vps74p 的糖基转移酶保留规定另据报道（28） 。

22、虽然 Vps74p，GPP34 和GPP34R 人类同源制止 vps74D 细胞（图 3G 和图。S9 的） ，植物和原生动物表型似乎缺乏同源蛋白 ofVps74p。因此，多种机制（1-3）可能功能，以确保正确定位高尔基居民糖基转移酶在细胞中。 参考文献与注释 1. K. J. Colley, Glycobiology 7, 1 (1997).2. A. S. Opat, C. van Vliet, P. A. Gleeson, Biochimie 83, 763(2001).3. S. R. Pfeffer, Annu. Rev. Biochem. 76, 629 (2007).4. S.

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