血检四项化学发光法调查.doc

1、血检四项化学发光法调查目前血检四项（HBsAg、HCV、HIV、TP）的检测方法主要有酶联免疫（ELISA）、核酸扩增（PCR）、胶体金标记、以及化学发光（CLIA）。现就 CLIA 在血检项目中的应用情况做一调查分析。一化学发光免疫分析法简介。化学发光免疫分析法(Chemiluminescence imnunoassay，CLIA)是建立在放射免疫分析技术(radioimmunoassay，RIA)理论的基础上，以标记发光剂为示踪物信号建立起来的一种非放射标记免疫分析法。CLIA是利用化学反应中释放大量自由能，产生激发态中间体，当其回到稳定的基态时发射出光子（h），用发光信号测量仪对所发出的

2、光量子进行定量测量。鲁米诺(1umino1)、异鲁米诺(isolumino1)及其衍生物、吖啶酯(acIidinim ester)衍生物、辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)是目前CLIA中使用最多的四类标记物。表1 化学发光法类型类型 原理及试剂 发光类型化学发光免疫分析（CLIA ）用化学发光物质直接标记抗原或抗体组成 吖啶酯（acrydinum esters）化学发光酶免疫分析（CLEIA ）不用化学发光物直接标记免疫制剂。在酶免疫分析完成后加入化学发光底物，产生化学发光1.辣根过氧化物酶(H

3、RP)/H 2O2/Luminol系统；2.碱性磷酸酶(AP)/1， 2 二氧乙烷稳定衍生物（AMPPD）系统 电化学发光免疫分析（ECLIA）应用电致化学发光标记物与电化学手段相结合产生化学发光的免疫分析三联吡啶钌（Rucbpy） 32+三丙胺氨系统微粒子酶联免疫（MEIA）*微粒子作为载体，标记酶催化底物产生荧光碱性磷酸酶作用于4_ 甲基磷酸伞型酮生成4-甲基伞型酮(MU)，MU产生出荧光，其荧光生成速率与被测物浓度相关。时间分辨免疫荧光分析（ TRFIA）*是用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物铕（ Eu 3+ ） 、 铽（ Te 3+ ）及钐（ Sm 3+ ） 、 镝（ De 3+ ）注

4、：* 严格意义上属于荧光免疫。二国内外化学发光法的仪器和试剂情况。国外化学发光法检测仪器的生产厂家以贝克曼、雅培、罗氏、拜耳这四家的市场占有率较高。其中罗氏拥有唯一的电化学发光技术，雅培则独占微粒子酶联免疫（EMIA）。不同厂家的仪器有各自的优势检测项目，主流的仪器型号如下：表 2 国外主要化学发光免疫分析仪厂家厂家 仪器 特点BECKMAN ACCESS/ACCESS2 激素全球最好。速度较慢，肿瘤证不全ROCHE Elecsys 2010/1010 项目比较全，速度比较快。试剂成本比较贵。Abbott Axsym/ i2000/i4000 药物浓度最好。消耗大，启动慢Bayer ACS 1

5、80/ADVIA centaur 速度比较快，但是故障高，维修成本贵国内也逐渐有厂家研制化学发光试剂，配合国外引进的仪器（多为半自动）共同销售，也有自发研制的化学发光仪（泰格科信）。针对血检四项（HBsAg、HCV、HIV、TP），除北京科美生物（科美东雅）外，所有厂家试剂均只有 HBsAg 试剂。表 3 国内主要厂家仪器和试剂情况公司 仪器 试剂北京源德生物 自有仪器 封闭试剂（HBsAg，无文号）北京泰格科信 自有仪器（ MP180，MP 280） HBsAg北京科美生物 进口仪器（BHP9504）日本滨松公司 四项试剂全（丙肝无文号） ，全球第一个 HIV 微板试剂盒，郑州安图 进口仪器

6、（Lucy2、Lucy3 ）奥地利 anthos 公司 HBsAg 有文号，无产品？厦门波生 进口仪器（VeritasTM）美国 Turner Biosystems HBsAg重庆（杭州）埃夫朗 仪器（国内） HBsAg洛阳 华美生物 ？ 无血检四项国外厂家的试剂大多随仪器配送，并没有在 SFDA 单独注册。目前 SFDA 注册的血检四项化学发光法试剂列表如下。就检测项目来看，除梅毒外，其余三项均可使用化学发光法；就现有资料，国内外只有北京科美东雅配有梅毒检测试剂。表 4 SFDA 注册的血检四项试剂项目 国内公司 国外公司HBsAg北京科美东雅，北京泰格科信，郑州绿科安图，重庆埃夫朗，厦门波

7、生，北京源德Roche，Ortho，Sorin，AbbottTP 北京科美东雅 HCV 北京科美东雅 Abbott，OrthoHIV 北京科美东雅 三化学发光法的优势及劣势。上世纪 70 年代末，Halmann 和 Vela 首先把化学发光(CL)与酶免疫反应结合起来，建立了化学发光酶免疫分析法(CLIA)。目前，它已成为生命科学研究中的一个重要的分析手段，广泛应用于核酸分析、蛋白质分析、免疫分析、进行基因分析、发光成像分析、细胞分析等方面。其主要优势有：1. 低检测限（高灵敏度）： 就 HBsAg 检测，国内 ELISA 试剂检测限平均为0.5ng/ml，而胡国茂等试验显示化学发光检测限可达

8、 0.1ng/ml。Thoai Duong Ly.等对欧洲常使用的 HbsAg 检测试剂进行评测，检测线检测（HbsAg 含量为 0.04ng/ml2.24ng/ml 的系列血清）结果显示各试剂盒灵敏度均低于 0.2ng/ml。值得注意的是，伯乐公司的Monalisa Ultra 酶联免疫试剂盒达到了 0.08ng/ml，甚至优于化学发光类仪器的检测。王丽梅等也证实 Abbott 的 Murex HBsAg 酶免试剂盒也可达到 0.1ng/ml 检测限。可以说，化学发光灵敏度只是优于目前的国内产品，单从技术角度，ELISA 应和化学发光法等优。表 5 五种 HBsAg 检测试剂灵敏度评价HBs

9、Ag试剂盒Advia Centaur HBsAgLiaison HBsAgVidas HBsAg UltraAxSym HBsAg V2Monolisa HBsAg Ultra公司 Bayer Dia-Sorin bioMerieux Abbott Bio-Rad方法 吖啶酯 鲁米诺 MEIA MEIA ELISA灵敏度 0.12 ng/ml 0.11 ng/ml 0.09 ng/ml 0.16 ng/ml 0.08 ng/m高的灵敏度检测能及早检出HBsAg，确证乙肝病毒感染，在病程观察中大大缩短“窗口期”时间。另外，电化学发光法定量检测，克服了定性对灰区结果的判断困难，对灰区结果能做出明确

10、客观的评价和判断。2. 宽的线性范围：一般来说，ELISA的检测范围为2-3个数量级，而化学发光可以达到46个数量级，且为线性范围。这说明不仅能检测低浓度，对高浓度样本同样具有良好的检测能力，并减少了出现钩状效应的几率。3. 分析速度快：由于采用自动化（半自动化）仪器，除去开机稳定、定标等时间，一般半小时内可以得到第一个标本结果，一小时可以出结果50-100个，这对于医院急诊病人非常重要。表6 几种化学发光免疫分析仪性能比较厂家 Roche Abbott Beckman Bayer DPC仪器 Elecsys 2010 AxSYM ACCESS ACS:180 Immulite原理 电化学 M

11、EIA ALP/鲁米诺 吖啶酯标记 ALP/dioxethane首结果时间 10 - 20 min 8 - 30 min 15 - 75 min 15 min 42 72 min结果/小时 57 - 72 60 - 100 0 - 75 100 - 130 0 - 45标本量 10 - 50 30 - 200 6 - 100 10 - 200 5 - 75 载机试剂稳定性 8 weeks 112 hrs 28 d 1.7 d 30 d试剂效期 6-12months 6 - 12 months 90 days 365 d 270 d4. 高稳定性： 由于全自动化操作，避免了人为的影响因素，结果的

12、重复性很高。章火祥使用卫生部定值血清HBsAg项室内质控血清，对Roche的2010化学发光免疫分析仪和厦门新创的ELISA试剂盒进行比较，结果显示cv值：ELISA法批内3 一5，批间5 一10 ，而ECL法批内小于3，批间小于5。马蔡昀对Roche的2010化学发光免疫分析仪和科华的ELISA试剂盒进行比较，结果亦显示电化学法比ELISA法的批内、批间cv值均小。5. 操作便捷：全自动化仪器，多数仅需加入一种试剂。虽然化学发光法是标记免疫技术的一项重要发展，也逐渐占据了主流市场，但并不是说没有其局限性。尤其是针对不同的检测项目，不同的地域差异，化学发光法并不能一统天下。ELISA法、金标法

13、、甚至放免法仍有广阔的用武之地。1. 不适于检测大量标本：自动化仪器虽然适宜于急性结果的报告，但对于大量样本的检测，显然ELISA发更具有优势。目前大型医院的门诊和住院标本采用仪器检测，而体检标本（200-400人/次）均采用ELISA法检测，这当然和检测费用以及结果的不急需有关。2. 检测费用高：根据北京市医疗服务收费标准。从下表可以看出，化学发光法的收费基本上是普通ELISA的5-7倍。这样的价格主要是由于昂贵的仪器以及后继的试剂消耗。国外厂家的封闭试剂造成了一定的垄断，也导致了价格的虚高。表7 北京市一些免疫检测项目收费情况国产 ELISA 进口ELISA 化学发光法/MEIAHBsAg

14、 7元/人 20元/人 35元/人Anti-HBs 7元/人 25元/人 40元/人HBeAg 7元/人 40元/人 50元/人Anti-HBe 7元/人 40元/人 50元/人Anti-HBc 7元/人 55元/人 HCV 20元/人 60元/人 90元/人3. 仪器维护需要专业人员：检验科医生经培训应能对仪器进行操作和简单维护，但由于仪器故障造成的试剂、标本浪费、报告延迟也会发生。这一点上，简便快捷的ELISA、金标法应具有很大优势。四化学发光在血筛中的应用前景。根据采供血机构质量管理规范 ，我国的国内血液筛查项目及检测方法如下表。 规范规定所有初筛（批批检四项检测）反应性标本必须使用与最

15、初检测相同的试剂和方法进行双次复检。两次复检结果均为无反应性，该血液和所制备的血液成分可以放行。表8 我国血站血液筛查检测项目实验项目 实验方法 试剂要求ABO 血型正反定型 玻片法/试管法/微板法 略。 。Rh 血型 D 抗原 玻片法/试管法/微板法 略。 。乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg） ELISA抗丙型肝炎病毒抗体（抗-HCV） ELISA抗艾滋病病毒抗体（抗-HIV1 和2） ELISA抗梅毒螺旋体抗体（抗-TP） ELISA梅毒血清反应素 TRUST/RPR试剂生产商应具有国家批准的相关资质，试剂应经过国家有关部门的批批检定。丙氨酸氨基移换酶（ALT） 赖氏法/酶动力学法 试剂生

16、产商应具有国 家批准的相关资质ELISA 法仍是主要的筛查方法，ELISA 方法简便、快速、可大量检测，且随着技术的不断改进，灵敏度/特异性也逐步提高。但也存在着一些问题，如(1)低滴度血清敏感性问题，如“窗口期”低滴度 HBsAg 的检测；(2)突变株的检测，如现有的 HBsAg 检测试剂均采用单克隆抗体，新的突变株不断出现，如何检测这些突变株。(3)ELlSA 检测试剂 H00K 效应和非特异性反应问题。化学发光法虽然灵敏度上优于 ELISA 法，但原理上属于同一大类（抗原抗体反应） ，对早期的感染也不会反应，对突变逃逸和 ELISA 面临同样的挑战，且目前对感染窗口期的检测能力也并没有过

17、多的文献研究。化学发光方法学上又分为许多类型，日后的标准制定也会有一定困难。目前部分地区也开始采用了PCR方法。免疫学检测以上三种病毒（HBV、HCV、HIV）的平均窗口期分别为：HBV：56天，HCV：70天，HIV：22天。在理论上，核酸检测（Nucleic acid test，NAT）技术能够显著的缩短病原体检出的窗口期。另外，NAT技术灵敏度和特异性均较显著的高于免疫学方法。核酸检测HBV，HCV，HIV病毒的窗口期较抗体检测分别提前：9天、25天、14天。但分子检测技术本身也存在一些问题：(1)汇集样本池的大小多少合适?(2)PCR引物的有效性。能否检测亚型和突变株感染?(3)PCR

18、扩增反应中抑制物的影响和控制；(4)试验的假阳性和假阴性问题等。我国的血液筛查还存在一个经济成本问题。目前每份血样的病毒筛查费用是 10-15 元/遍，化学发光法应为 30-50 元/遍，而如果要采用 NAT，费用将上升到 200-300 元，这将极大的限制 NAT 的实际应用。解决这一问题的方法，就是大幅度提高 NAT 试剂的灵敏度，以实现对 10 至 12 份血样的混合检测（pooling） ，这样，平均每份血样的病毒筛查费用将下降，为实际推广应用铺平道路。五小结综合来看，化学发光是一类逐渐成熟，且必将在一段时期占据市场的检测方法，随着经济水平的提高，越来越多的医疗机构已经引进了此项技术。

19、随着我国对血液制品的管理严格，血液筛查需要引入更灵敏、可靠的方法，从国际经验来看，NAT 技术应是首选。化学发光和 ELISA 都需要提高技术，对抗原/抗体进行不断改进。ELISA 的优势是价格便宜，适于大量检测；化学发光的优势是自动化。附：表 9 血检四项试剂 SFDA 注册情况方法 国内 国外HBsAg酶联免疫法 45 家Organon Teknika ，Sorin，Ortho，Mrieux，Abbott化学发光法北京科美东雅，北京泰格科信，郑州绿科，重庆埃夫朗，厦门波生，北京源德Roche，Ortho，Sorin，Abbott免疫荧光 达安基因MEIA Abbott胶体硒试纸条 Abbo

20、ttTRFIA 中山生物，苏州新波放射免疫法 北京原子高科，天坛生物，北京科美 东雅，福瑞生物，北京北方生物胶体金法 科华，玛诺，新创，蓝十字，万泰， 北京希波，杭州艾康，郑州博赛TPELISA 17 梅里艾TPHA Omega（苏格兰）TPPA 富士株式会社TRUST 12RPR 科卫、天坛、未名胶体金 万泰 万孚 肝炎试剂研制中心HCVELISA 36 Ortho, 亚特斯（意大利） ，Abbott，Sorin胶体金 深圳瑞莱蛋白芯片 深圳益生堂PCR 匹基、达安、华美、科华、肝炎试剂 研制中心 Chiron，EMIA Abbott胶体金 新创HIVELISA 29 N胶体金 17 NWB 杭州澳亚 GenelabPCR 匹基 Roche, Chiron,梅里埃第四代 Abbott，梅里埃