pet表达系统.doc

1、对于全世界许多研究者， Novagen 的 pET 系统已成为在大肠杆菌中蛋白表达的首选。该系统成功的一个主要原因是目标基因被克隆到不为大肠杆菌 RNA 聚合酶识别的 T7 启动子之下，因此在加入 T7 RNA 聚合酶之前几乎没有表达发生。克隆到 pET 载体的基因实际上是被关闭的，不会由于产生的蛋白对细胞有毒性而引起质粒不稳定。重组质粒转移到染色体上含有一拷贝由 lacUV5 控制的 T7 RNA 聚合酶基因的表达宿主中，并通过加入 IPTG 诱导表达；也可通过 l CE6 感染原始克隆宿主菌来提供 T7 RNA 聚合酶。使用大肠杆菌启动子系统 ( 如 tac 、 lac 、 trc 、 p

2、L) 有困难的许多基因已经在 pET 系统中稳定克隆和表达。 T7 RNA 聚合酶的选择性和活性使得几乎所有细胞资源都用于为目标基因表达。诱导后几小时目标产物就可超过细胞总蛋白的 50% 。新开发的 T7 驱动表达技术以 pETBlue TM 系统为代表。 pETBlue 载体包括了 pET 用于表达的优点，在目标基因克隆和质粒 DNA 操作的方面更为方便。 pETBlue TM 系统：新一代 T7 表达载体pETBlue 载体代表了新型表达载体，它具备所有广受欢迎的克隆载体的最理想特点和 T7 驱动蛋白表达的完全功能。目标基因以相对于修饰的大肠杆菌 tet 启动子的反义方向插到 lacZ a

3、 - 肽编码区，因此可进行蓝 / 白斑筛选。正确定位于目标基因正义方向上游的 T7 转录和翻译信号使表达成为可能。与标准 pET 载体一样，通过转化 DE3 溶原菌并用 IPTG 诱导或通过 l CE6 感染原始宿主菌生产目标蛋白。优点 蓝 / 白斑筛选，便于克隆 高拷贝数，质粒 DNA 高产 以 AccepTor TM 载体或 perfectly Blunt a 载体形式提供，便于快速 PCR 克隆 目标基因无基础水平表达，消除了毒性基因产物相关的质粒不稳定性 表达水平与经典 pET 载体相同 用 Tuner TM (DE3)pLacI 宿主菌实现真正的表达水平“变阻器”控制。PET 系统：

4、大肠杆菌中蛋白表达的金字招牌pET 载体中，目标基因克隆到 T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供 T7 RNA 聚合酶来诱导表达。 Novagen 的 pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括 36 种载体类型、 15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。优点 是原核蛋白表达引用最多的系统 在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低 真正的调节表达水平的“变阻器”控制 提供各种不同融合标签和表达系统配置 可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌 许多载体以 LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆

5、PCR 产物 许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化阳性 pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆 PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。pETBlue TM 系统T7 驱动的严紧控制表达、蓝 / 白斑筛选、质粒产量高新颖的 pETBlue TM 系统兼有广受欢迎的蓝 / 白斑筛选载体所具有的通过目测确定重组体和高质粒拷贝数，以及 pET 载体严紧控制的高蛋白表达等特点。蓝 / 白斑筛选通过使用弱组成型大肠杆菌启动子 ( tet ) 驱动 lacZ a - 肽表达而实现，而目标基因表达由相反方向的 T7 启动子驱动。目标序列插入多克隆位点（ MCS ）破坏了 lac

6、Z a - 肽的表达，在 NovaBlue 菌株中当存在 x-gal 时产生白菌落表型，而带有非重组载体的菌落变蓝。由于 T7 驱动的蛋白表达要求插入片段克隆到相对于 tet 启动子的反义方向，因此实际上没有目标序列的基础表达。相对于 pET 载体， pETBlue 质粒上高拷贝 PUC 复制起点增加了质粒产量，为测序、突变和其它质粒操作带来方便。如果插入序列相对于 T7 lac 启动子为正义方向且符合每个载体的翻译要求， pETBlue 载体中目标基因可以高水平表达。用两种方法进行蛋白表达：用 l CE6 （ l pL 启动子控制 T7 RNA 聚合酶表达的噬菌体）感染，或转化重组 pETB

7、lue 质粒到宿主菌 Tuner TM (DE3)pLacI 或 Origami TM (DE3)pLacI 中并用 IPTG 诱导。这些宿主菌染色体上带有一拷贝 lacUV5 控制的 T7 RNA 聚合酶基因，并通过相容的 pLacI 质粒提供足够 lac 阻遏蛋白，以确保低水平的未诱导表达。 Tuner 菌株的 lacY 状态使整个培养细胞被均一的诱导，并随 IPTG 剂量诱导有不同的蛋白表达水平。 Origami 菌株能够增强胞质中二硫键形成。pETBlue-1pETBlue-1 便于从 5 端编码开放读码框架的插入片段表达未融合的天然蛋白。该载体 EcoR V (GATATC) 克隆位

8、点位于强 T7 基因 10 核糖体结合位点（ RBS ）附近。含有 ATG 起始密码子或 5 端具有一个位置合适的 G 核苷酸插入片段成为一个合适的大肠杆菌翻译起始位点。pETBlue-2pETBlue-2 提供了载体编码的 ATG 起始密码子和多种下游克隆位点。 MCS 5 和 3 端两套各三个重叠平末端酶切位点便于将任何插入片段克隆到读码框中。在载体确定的读码框中，这些酶产生的平末端终止于密码三联体的不同位置。因此只要插入方向正确，任何插入片段可克隆到经过合适平末端酶切割的载体的读码框中。而且，任何不含内部终止密码子的插入片段都可与 C- 末端 HSV.Tag a 表位和 His.Tag

9、a 序列克隆到同一读码框中。pETBlue TM PCR 克隆试剂盒方便地将 PCR 扩增 DNA 直接克隆到 pETBlue 载体中除了含有未切割质粒的 pETBlue TM 系统， Novagen 还提供可立即插入 PCR 产物的 pETBlue 载体。已有两种试剂盒： AccepTor TM 载体试剂盒能够插入带单个 3 -dA 突出的 DNA ，如非校对 DNA 聚合酶 ( 如 Taq DNA 聚合酶 ) 的扩增产物；而 perfectly Blunt a 克隆试剂盒设计用于克隆任何末端形式的插入片段。在 pETBlue-1 AccepTor 载体中表达插入基因的引物设计：pETBlu

10、e-1 ：用 5 端 ATG 开始的正义引物进行扩增，能够确保在大肠杆菌中有效合成蛋白的 RBS 和翻译起始位点之间的最适距离。目标序列羧基端引物设计没有限制。Met-正义引物 5 -ATG XXX -反义引物 无限制pET 系统概述pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由 Studier 等开发的 T7 启动子驱动系统， Novagen 的 pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。控制基础表达水平pET 系统提供 6 种载体 - 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。宿主菌株质粒在非

11、表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有 T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（ DE3 溶原菌）中表达目标蛋白。在 DE3 溶原菌中， T7 RNA 聚合酶基因由 lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有 pLysS 和 pLyE 时调控会更严紧。 pLys 质粒编码 T7 溶菌酶，它是 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。 pLysS 宿主菌产生低量 T7 溶菌酶，而 pLysE 宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的 DE3 溶原菌。有 11 种不同 DE3 溶原化宿主

12、菌。使用最广泛的为 BL21 及其衍生菌株，它的优点在于缺失 lon 和 ompT 蛋白酶。 B834 菌株为甲硫氨酸营养缺陷型，因此可用 35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。 BLR 为 recA - 衍生菌株，改善了质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列的目标质粒。两个硫氧还蛋白还原酶 ( trxB ) 突变菌株 (AD494,BL21 trxB ) ，有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。 Origami TM 和 OrigamiB 菌株为 trxB/gor 双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。 Origami 和 OrigamiB 宿主菌的主要优点是能形成正确折

13、迭的含有二硫键的蛋白。新的 Rosetta TM 菌株补充了四种大肠杆菌稀有密码子的 tRNA ，改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达。其它菌株背景包括 K-12 菌株 HMS174 和 NovaBlue ，象 BLR 一样为 recA - 。这些菌株可稳定表达其产物可能导致 DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。由于存在 F 附加体编码的高亲和力 lacIq 阻遏蛋白， NovaBlue 为一个有用的严紧型宿主菌。此外， Novagen 提供了 DE3 溶原化试剂盒，用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。表达高毒性基因或制备新的 DE3 溶原菌的另一替代方法是通过 l CE6 感

14、染提供 T7 RNA 聚合酶。虽然不如用 IPTG 诱导 DE3 溶原菌方便，这种策略也被优先用于一些应用中。高严紧性 T7 lac 启动子除了在宿主菌水平选择三种基本的表达严紧性， pET 系统中 T7 启动子本身提供了两种不同的严紧性选择：普通 T7 启动子和 T7 lac 启动子。 T7 lac 启动子在启动子区下游 17bp 处含有一个 25bp 的 lac 操纵序列。该位点结合 lac 阻遏蛋白能够有效降低 T7 RNA 聚合酶的转录，这样提供了在 DE3 溶原菌中抑制基础表达的第二种基于 lacI 的机制（除了抑制 lacUV5 ） 。含 T7 lac 启动子的 pET 质粒还具有

15、它们自己的 lacI ，确保足够的阻遏蛋白结合到操纵基因位点上。在实际应用中，为了获得最高产量的蛋白，通常应该测试多种不同的载体 / 宿主菌组合。控制诱导的表达水平在许多情况下，表达活性可溶性最好的蛋白依赖于宿主细胞的背景、培养条件和合适的载体配置。通常，目标蛋白活性最高的条件与产量最高的条件不一致。除了根据载体 / 宿主菌组合控制 T7 RNA 聚合酶的基础表达提供不同严紧性， pET 系统还根据诱导物（ IPTG ）浓度，对目标蛋白表达提供了真正的“变阻器”控制。 Tuner 和 OrigamiB 宿主菌的 lacY 突变使这种控制成为可能。选择 pET 载体所有的 pET 载体均来自 p

16、BR322 ，但彼此间先导序列、表达信号、融合标签、相关限制性位点和其它特点有所不同。有两大类 pET 质粒，即转录载体和翻译载体：转录载体（包括 pET-21 、 pET-23 和 pET-24 ）表达目标 RNA ，但不提供翻译信号。它们用于从自身带有细菌翻译信号的目标基因表达蛋白。 （注意：转录载体通过命名后面的一个缺失字母后缀加以区分）翻译载体含有设计用于蛋白表达的有效翻译起始信号。许多载体在读码框 a 、 b 和 c 中带有克隆位点，分别对应于 BamH I 位点的 GGA 、 GAT 和 ATC 三联体。选择要点选择用于表达的 pET 载体通常涉及多种因素。考虑以下三个主要因素：

17、所表达蛋白的用途 所表达蛋白的已知信息 克隆策略pET 载体表达的蛋白用途各种各样。例如，表达量为分析级的蛋白可用于活性研究、突变体筛选和定性、筛选配体相互作用和抗原制备。大量活性蛋白用于结构研究、试剂或亲和基质制备。许多载体适合表达用于筛选或抗原制备的分析量蛋白，然而只有载体、宿主菌和培养条件组合十分适宜才可能用于大量纯化。如果需要活性蛋白连续高产，应该试验多种载体、宿主菌和培养条件组合以找到最优化结果。任何关于目标蛋白的已知信息都有助于载体选择。例如，一些蛋白的活性要求一个或两个末端没有外源序列。许多 pET 载体能够克隆非融合序列，然而如果特定翻译起始序列不能在大肠杆菌中有效利用，表达水

18、平可能受影响。在这些情况下，常可用有效表达的氨基末端序列构建融合蛋白，然后在纯化后用位点特异性蛋白酶消化去除融合序列。 LIC （连接非依赖的克隆）策略对这种方法特别有用，因为克隆操作通过肠激酶和因子 Xa 能够去除所有氨基端载体编码序列。由于限制性位点和读码框相容性的需要，克隆策略也会影响载体选择。由于许多 pET 载体具有共同的限制性位点配置，通常可能将一次制备的目标基因克隆到几个载体中。采 PCR 克隆策略时则有不同的考虑。 LIC 载体试剂盒推荐用于此目的，可通过 PCR 制备插入片段，而不需要限制性消化载体或插入片段。溶解性和细胞定位考虑了目标蛋白的应用和克隆策略，还应该确定目标蛋白

19、的细胞定位和溶解性，这一点十分重要。在许多实际应用中常希望表达可溶的活性蛋白。特定目标蛋白的溶解性取决于多种因素，包括各自的蛋白序列。在许多情况下，溶解性不是有或无的现象，载体、宿主菌和培养条件可被用来增加或减少获得的可溶或不可溶形式的比例。 PET-32 载体系列使目标序列与通常能够增加可溶性蛋白比例的硫氧还蛋白 (Trx.Tag ) 融合。新推出的 pET-43.1 系列具有通过大量系统筛选而得到的一种过量表达时具有极高溶解性的大肠杆菌蛋白 -Nus.Tag 融合伴侣，从而进一步提高了目标蛋白的可溶性。此外， trxB 突变株 AD494 和 BL21 trxB ，或 trxB/gor O

20、rigamiTM 和 OrigamiB 菌株可用于在胞浆中形成许多真核蛋白正确折迭和活性所要求的二硫键。低温诱导（ 15 -25 C ）也可增加可溶性目标蛋白的比例。获得可溶性活性蛋白的另一策略是使蛋白外泌到胞外周质中，为折迭和二硫键形成有更适宜的环境。为了达到这一目的，通常使用带信号肽的载体。一些纯化策略可以优化胞质中不溶性包涵体的产量。抽提包涵体并溶解，然后目标蛋白在体外重新折迭 ( 如使用 Novagen 的蛋白折迭试剂盒 ) 。该过程通常产生高产量初始蛋白并防止宿主细胞中的蛋白降解。然而，重新折迭成活性蛋白的效率随不同蛋白变化很大，可能相当低。 pET-31b （ + ）载体专为产生不

21、可溶融合蛋白而设计，提供了生产小蛋白和多肽的有效方法。满足不同需要的融合标签如果融合序列不影响应用，生产带有 S.Tag 、 T7.Tag a 、 His.Tag a 和 HSV.Tag a 的融合蛋白会很方便后续操作，并易于通过蛋白杂交检测。这些多肽（融合序列很小） ，它们的检测试剂极特异和灵敏。通过使用相应树脂和缓冲液试剂盒， GST.Tag 、 S.Tag 和 T7.Tag 序列可用于亲和纯化。使用 S.Tag 和 GST.Tag 分析试剂盒可对粗提或纯化的融合蛋白准确定量。采用一种新颖底物的 FRETWorks S.Tag 分析试剂盒可通过荧光检测到少于 1fmol 的融合蛋白。His

22、.Tag a 序列作为纯化蛋白的融合伴侣非常有用，尤其对那些以包涵体形式表达的蛋白来说，它可以使亲和纯化可在溶解蛋白的完全变性条件下进行。CBD.Tag a 在低费用亲和纯化中非常有用。它们也特别适用于重新折迭（特别是带有 CBD clos .Tag a 序列的 pET-34b （ + ）和 35b （ + ） ） 。因为只有正确重新折迭的 CBDs 结合到纤维素基质上， CBIND 亲和纯化步骤能够从制备物中去除不正确折迭的分子。任何标签可用于固定目标蛋白，但由于 CBD.Tag 序列的低非特异性结合以及与纤维素基质的生物相容性，使它更适合用于这一目的。Nus.Tag 、 Trx.Tag 和

23、 GST.Tag 序列用来增加其融合伴侣的溶解性。 Nus.Tag 和 Trx.Tag 载体与利于在胞浆中形成二硫键的 Origami 宿主菌相容。各种融合标签和相应 pET 载体见列表。一些 pET 载体带有数个串联的融合标签，作为 5 融合伴侣。此外，许多载体通过目标基因序列符合读码框的通读而表达末端带有不同多肽标签的融合蛋白。使用在 5 标签和目标序列之间含有蛋白酶切割位点（凝血酶、因子 Xa 和肠激酶）的载体，可以在纯化后选择性去除一个或多个标签。 pET-30 Ek/LIC 、 pET-32 Ek/LIC 、 pET-34 Ek/LIC 和 pET-36 Ek/LIC 是细胞定位和亲

24、和标签配置良好的代表。 pET Ek/LIC 载体 Combo 试剂盒包括所有 4 种即用型载体，可直接用于构建数种目标基因构型。pET NusA 融合系统 43.1在大肠杆菌中生产可溶性活性蛋白新推出的 pET NusA 融合系统设计用于克隆和高水平表达与 495aa NusA （ Nus.Tag ）蛋白融合的多肽序列。对数据库中 4000 个以上蛋白进行可溶性建模， NusA 蛋白被确认为具有最高的可溶性。在用四种不同 NusA 融合蛋白进行的试验中，大于 85% 的表达蛋白都是可溶的。 pET-43.1 载体含有 Nus.Tag 融合伴侣并与 trx/gor 突变体 Origami 和

25、OrigamiB 菌株相容，有利于在胞浆中形成二硫键。使用 pET-43.1 载体和这些 trx/gor 宿主菌组合可能获得二硫键结合的蛋白。优点 高可溶性的 N- 末端 Nus.Tag 融合伴侣 上游 His.Tag a 、 S.Tag 和可选择的 C- 末端 HSV.Tag a 、 His.Tag 融合标签 凝血酶和肠激酶切割位点 多克隆位点位于所有读码框中 与 AD494 和 Origami 宿主菌株相容，可促进表达蛋白的正确折迭pET 宿主菌株感受态细胞所有 pET 系统宿主菌以预测试的感受态细胞形式提供，可立即用于转化。（ DE3 ）指宿主为 DE3 溶原菌，其染色体上带有一拷贝由

26、lacUV5 启动子控制的 T7 RNA 聚合酶基因。这类菌株适用于从克隆到 pET 载体的目标基因生产蛋白。命名为 pLysS 和 pLysE 的宿主菌带有编码 T7 溶菌酶（为 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物）的 pET 相容性质粒。带有 pLysS 的细胞产生少量溶菌酶，而 pLysE 宿主菌产生更大量酶。这些菌株用于在诱导前抑制 T7 RNA 聚合酶的基础表达，这样可以稳定编码影响细胞生长和活力的目标蛋白的 pET 重组体。带有 pLacI 的宿主菌产生额外的抑制 pETBlue 和 pTriEx 载体基础表达的 lac 阻遏蛋白。 DE3 溶原化试剂盒用于制备其它遗传背景的新表达宿

27、主菌。AD494 菌株为硫氧还蛋白还原酶 ( trxB ) 突变菌株，能够在胞浆内形成二硫键，提供了生产正确折迭的活性蛋白的潜力。 TrxB 突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的质粒。B834 为 BL21 的亲本菌株。这些蛋白酶缺陷宿主菌为甲硫氨酸营养缺陷型，可用 35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记，从而用于结晶学研究。BL21 应用最广的宿主菌来源，具有 lon 和 ompT 蛋白酶缺陷的优点。BL21 TrxB 菌株在蛋白酶缺陷 BL21 背景上具有与 AD494 菌株相同的硫氧还蛋白还原酶突变 ( trxB ) 。由于 trxB

28、 宿主有利于胞浆内二硫键形成，它们的使用可增加正确折迭的蛋白组分。 TrxB 突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的质粒。BLR 为 BL21 的 recA - 衍生菌株，能够改善质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列或其产物能够引起 DE3 噬菌体丢失的目标质粒。HMS174 菌株在 K-12 背景上提供了 recA 突变。与 BLR 一样，这些菌株能够稳定其产物能够引起 DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。NovaBlue 适合 用作初始克隆宿主菌的 K-12 菌株，具有高转化效率、蓝 / 白斑筛选能力（与合适质粒）和导致优质质粒 DNA 高产的 recA endA

29、 突变。由于存在 F 附加体编码的 lacI q 阻遏蛋白， NovaBlue 的 DE3 溶原菌是一个非常有用的严紧型宿主菌。Origami 为 K-12 衍生的宿主菌，硫氧还蛋白还原酶突变 ( trxB ) 和谷胱甘肽还原酶 ( gor ) 基因均为突变，能够大大增强胞浆内二硫键的形成。研究表明即使总体表达水平相似， Origami （ DE3 ）表达的活性蛋白比其它宿主菌高 10 倍以上。 Origami 宿主菌与氨苄抗性质粒相容，可用于 pET-32 载体，硫氧还蛋白标签能够进一步增强在胞浆内形成二硫键。 TrxB 和 gor 突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄

30、抗性标记 bla 的 pET 质粒。Origami B 宿主菌来源于 BL21 lacZY 突变株，还带有与原始 Origami 菌株相同的 TrxB / gor 突变。 Origami B 菌株集 BL21 、 Tuner 和 Origami 宿主菌的优点于一体。 TrxB 和 gor 突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的 pET 质粒。Rosetta 宿主菌从 BL21 衍生而来，可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子 AUA 、 AGG 、 AGA 、 CUA 、 CCC 和 GGA 的 tRN

31、As 。这样 Rosetta 菌株提供了“ 万能”的翻译，从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制。 tRNA 基因由它们的天然启动子驱动。在 Rosetta （ DE3 ） pLysS 和 Rosetta （ DE3 ） pLacI 中，稀有 tRNA 基因存在于分别带有 T7 溶菌酶和 lac 阻遏基因的同一质粒上。Tuner 菌株为 BL21 的 lacZY 缺失突变株，能够调整培养物中所有细胞的蛋白表达水平。lac 通透酶（ lacY ）突变使得 IPTG 均匀进入群体所有细胞，从而具有浓度依赖、水平均一的诱导表达。通过调整 IPTG 浓度，表达可从极低水平调节到极强、完全诱导的表达水平（通常与 pET 载体相关） 。低水平表达有时可能增强难表达蛋白的溶解性和活性。 Tuner （ DE3 ） pLacI 菌株与 pETBlue 和 pTriEx 载体的表达相容。