人白细胞介素6IL-6酶联免疫分析ELISA.DOC

1、 1 人白细胞介素 6(IL-6)酶联免疫分析 (ELISA) 试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供科研使用。 本试剂盒用于体外定量检测人血清、血浆、组织、细胞上清及相关液体样本中白细胞介素 6(IL-6)的含量。 有效期： 6个月 保存条件： 2-8 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定 标本 中 人白细胞介素 6(IL-6)水平。用纯化的 人白细胞介素 6(IL-6)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入 白细胞介素 6(IL-6)，再与 HRP标记的白细胞介素 6(IL-6)抗体结合，形成抗体 -抗原 -酶标抗体复合物 ，经过彻底洗涤后 加 底物 TMB显色。 TMB在 H

2、RP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的 白细胞介素 6(IL-6)呈正相关。用酶标仪在 450nm波长下测定吸光度（ OD值）， 通过标准曲线 计算样品 中人白细胞介素 6(IL-6)浓度。 试剂盒组成 试剂盒组成 48 孔配置 96 孔配置 保存 说明书 1 份 1 份 R.T. 封板膜 2 片（ 48） 2 片（ 96） R.T. 密封袋 1 个 1 个 R.T. 酶标包被板 148 196 2-8 保存 标准品： 90ng/L 0.5ml1 瓶 0.5ml1 瓶 2-8 保存 标准品稀释液 5ml1 瓶 5ml1 瓶 2-8 保存 酶标试剂 3 m

3、l1 瓶 6 ml1 瓶 2-8 保存 样品稀释液 3 ml1 瓶 6 ml1 瓶 2-8 保存 显色剂 A 液 3 ml1 瓶 6 ml1 瓶 2-8 保存 显色剂 B 液 3 ml1 瓶 6 ml1 瓶 2-8 保存 终止液 3ml1 瓶 6ml1 瓶 2-8 保存 20X 浓缩洗涤液 15ml1 瓶 25ml1 瓶 2-8 保存 样本处理及要求 1. 血清：室温血液自然凝固 10-20 分钟 ，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 /分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后

4、，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 /分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应2 该再次离心。 3. 尿液：用无菌管收集，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 /分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心 20 分钟左右（ 2000-3000转 /分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用 PBS（ PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到 100 万 /ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 /分

5、）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的 PBS， PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持 2-8的温度。加入一定量的 PBS（ PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 /分）。仔细 收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可 将标本放于 -20保存，但 应 避免反复冻融 . 7. 不能检测含 NaN3 的样品 ，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（ HRP）活性。

6、操作步骤 1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔 10 孔，在第一、第二孔中分别加标准品 50 l，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液 50 l，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取 50 l 分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液 50 l，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取 50 l 弃掉，再各取 50 l 分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液 50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取 50 l 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液 50 l，混匀后从第七、第八孔中分别取 50 l 加到第九、第十孔中，再在第九第

7、十孔分别加标准品稀释液 50 l，混匀后从第九第十孔中各取50 l 弃掉。（稀释后各孔加样量都为 50 l，浓度分别为 60ng/L， 40 ng/L， 20 ng/L，10 ng/L， 5 ng/L）。 2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、 待测样品孔 。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40 l，然后再加待测样品10 l（样品最终稀释度为 5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻 晃动 混匀 。 3. 加酶：每孔加入酶标试剂 100 l，空白孔除外 。 4. 温育：用封板膜封板后置 37温育 60 分钟 。 60 ng/L

8、40 ng/L 20 ng/L 10 ng/L 5 ng/L 90 ng/L 3 5. 配液：将 20 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 20 倍稀释后备用。 6. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体， 甩干 ，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干。 7. 显色：每孔先加 入显色剂 A50 l，再加入显色剂 B50 l，轻轻震荡混匀， 37避光显色 15 分钟 . 8. 终止：每孔加终止 液 50l ，终止反应 （此时蓝色立转黄色） 。 9. 测定：以空白孔调零， 450nm 波长依序测量各孔的 吸光 度（ OD 值） 。 测定应在加终止液后 15 分钟以内进行。 注意事项 1 试剂盒

9、从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 1. 浓洗涤液 可能 会有 结晶 析出，稀释时可在水浴中加温助溶 ，洗涤时不影响结果。 2. 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。 一次加样时间最好控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 3. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本 OD值大于标准品孔第一孔的 OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（ n 倍）后再测定，计算时请最后 乘以 总稀释倍数（ n 5）。 4. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 5.

10、 底物请避光保存。 6. 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准 . 7. 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 8. 本试剂不同批号组分不得混用。 10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。 计算 以标准物的浓度为横坐标， OD 值为纵坐标， 在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的 OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以 稀释 倍数 ；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标 准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值 代入方程式，计算出样品浓度，再乘以 稀释 倍数 ，即为样品的实际浓度。 （此图仅供参考） 试剂盒性能 1.样品线性回归与预期浓度相关系数 R 值为 0.95 以上。 2.批内与批间应分别小于 9%和 15% 检测范围： 2 ng/L -80 ng/L