RP-HPLC同时测定鼠掌老鹳草中5种活性成分的含量.DOC

1、 - RP-HPLC 同时测定鼠掌老鹳草中 5 种活性成分 的含量 罗宏， 尹海波 （ 辽宁中医药大学药学院 ， 辽宁 大连 116600） 摘要 目的： 建立 HPLC 法同时测定鼠掌老鹳草中没食子酸 ,原儿茶酸 ,槲皮素 ,山奈素 ,山奈素 -3,7-O- -二鼠李糖苷的含量测定方法。 方法 ：采用 RP-HPLC 法 ， AgilentTC -C18色谱柱 (250mm*4.6mm)， 0.4 磷酸水溶液 -甲醇为流动相梯度洗脱， 流速 0.8mLmin-1,检测波长为 切换波长 ,(0-23min)波长 270nm;(23-55min)波长 370nm.柱温 30。 结果 ：没食子酸

2、,原儿茶酸 ,槲皮素 ,山奈素 ,山奈素 -3,7-O- -二鼠李糖苷的线性范围 为 :0.1921.732g.L-1(r=0.9997) , 0.0160.256g.L-1 (r=0.9999), 0.0040.039g.L-1(r=0.9999), 0.0040.041g.L-1 (r=0.9999),0.20041.6032g.L-1 (r=0.9998) ,平均回收率（ n=3） 分别为 100.07% (RSD1.5%),99.55% (RSD1.7%) ,100.28% (RSD2.2%),99.99% (RSD1.8%),99.90% (RSD1.0%)。 结论 ： 该 含量测定

3、的方法 快速、准确、可靠、重复性好，可为 药材 的质量 控制 提供依据 。 【 关键词 】鼠掌老鹳草；没食子酸；原儿茶酸；槲皮素；山奈素； HPLC Simultaneous determination of five active compounds in Geranium sibiricum L. by RP-HPLC LUO Hong, YIN Haibo (Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China) Abstract Objective: To determine 5 active

4、 compounds in Geranium sibiricum L., namely gallic acid, protocatechuin acid, quercetin, kaempferol-7-O-rhamnoside and kaemferitrin. Method: The RP- HPLC method was applied and the separation was performed on an Agilent TC-C18 analytical column( 250mm4.6mm,5m). The mobile phase was methanol (A)- wat

5、er containing 0.4% H3PO4(B) with gradient elution mode at the flow rate of 0.9 mL min.The detection was set at 270nm (0-23min),370nm(23-55min),and the column temperature was 30 . Result: The liner ranges of Gallic acid,protocatechuin acid,quercetin, kaempferol-7-O-rhamnoside and kaemferitrin were 0.

6、1921.732g.L-1(r=0.9997),0.0160.256g.L-1(r=0.9999), 0.004 0.039g.L-1(r=0.9999), 0.004 0.041 g.L-1(r=0.9999),0.20041.6032 g.L-1 (r=0.9998). The average recoveries (n=3) were 100.07%(RSD1.5%),99.55%(RSD1.7%),100.28%(RSD2.2%),99.99%(RSD1.8%),99.90%(RSD1.0%). Conclusion: The methord is simple and accurat

7、e with a good reproducibility and can be used as a quality control methord for Geranium sibiricum L. of different sources. Key words Geranium sibiricum L.; Gallic acid; Protocatechuin acid; Quercetin; Kaempferol-7-O-rhamnoside; HPLC 老鹳草为 我国传统 中药，来源于牻牛儿苗 科 植物牻牛儿苗（ Erodium stephanianum Willd.） 、老鹳草（ G

8、eranium wilfordii Maxim.） 或野老鹳草 (Geranium carolinianum L.)的干燥地上部分 ,收载于我国 10版药典， 前者习称 ”长嘴老鹳草 ”， 后 两 者习称 ”短嘴老鹳草 ”1。 性辛、苦、平，归肝、肾、脾经，祛风湿、通经络、主治筋骨酸痛、泄泻痢疾等 2。我国老鹳草药材资源丰富， 老鹳草属多种植物在不同地区作老鹳草药材使用 。 鼠掌老鹳草（ Geranium sibiricum L.）为正品老鹳草的同科属植物，虽非药典收载品种，但资源分布广泛，且以北方为多， 前期研究发现 在 全国 很多 地区 均 替代 正品 老鹳草使用，因此对其进行 全面的质量

9、评价 对于控制老鹳草药材的质量 具有十分重要的意义。 鼠掌老鹳草的活性成分包括鞣质、黄酮、有机酸及挥发油等 3-4， ， 其中 黄酮类化合物具有较好的降脂、抗血栓、抗氧化、降糖等活性 【 5】 ；鞣质具有抗肿瘤、抗过敏、抗衰老等 【 6】 作用， 有机酸类成分 为 鞣质 的水解产物 ， 也具有明显的抗菌、抗炎的作用 。 因此 为了进一步开发利用该药材资源， 全面控制 和评价 药材的 质量，本实 验 建立了 HPLC同时测定该药材中 3种 黄酮类和 2种酚酸类 活性 成分 没食子酸 、 原儿茶酸 、槲皮素 、 山奈 素 、 山奈素 -3,7-O- -二鼠李糖苷 含量 的 方法。 - 1 仪器 与

10、 材料 Agilent1100 型 高效液相色谱仪 ,Agilent TC-C18色谱柱， SPD-10A 紫外检测器 ,四元低压梯度泵 ， 柱温箱 , KQ3200 超声波清洗 器 （昆山市超声仪器有限公司）， CP225D 电子天平（德国 Sartorius 公司 ）。 甲醇为 色谱纯，水为重蒸水 ，其它试剂均为分析纯 。 对照品： 没食子酸（中国药品生物制品检定所，110831-200302） ； 原儿茶酸（ 中国药品生物制品检定所， 110809-200604） ； 槲皮素（ 中国药品生物制品检定所， 100081-200406） ； 山奈素（中国药品生物制品检定所， 110809-2

11、00604） ； 山奈素 -3,7-O- -二鼠李糖苷 （自制） ，对照品纯度均 98%。 试验 用 30 批鼠掌老鹳草 药材 自采 于 2009 年 7 月 -2010 年 6 月，见表 1，经辽宁中医药大学药用植物教研室尹海波副教授鉴定， 凭证标本保存于本 院 药用植物教研室 。 表 1 鼠掌老鹳草样品 来源 信息 Tab.1 origin Sources of Geranium sibiricum L. 编号 产地 生态环境 编号 产地 生态环境 编号 产地 生态环境 S1 吉林通化集安 路边草丛 S11 黑龙江 铁力 林场路旁 S21 辽宁海城 路边草丛 S2 吉林梅河口 路边草丛 S

12、12 黑龙江哈尔滨 山 坡 林缘 S22 辽宁沈阳 山坡林下 S3 吉林磐石松川 路边草丛 S13 辽宁铁岭 稻田地边 S23 辽宁锦州 水沟边 S4 吉林省吉林市 公园绿地 S14 辽宁鞍山 山坡林缘 S24 北京香山 山坡路旁 S5 吉林敦化 山阴坡 S15 辽宁大连庄河 路边草 丛 S25 山东泰山 山坡路旁 S6 吉林安图 路边草丛 S16 辽宁丹东凤城 山坡林 缘 S26 河北成德 路边草丛 S7 黑龙江牡丹江 路边草丛 S17 辽宁葫芦岛 水沟边 S27 天津蓟县 山坡林下 S8 黑龙江鸡西 林场林下 S18 辽宁锦州 路边草丛 S28 青岛崂山 路边草丛 S9 黑龙江七台河 路边

13、草丛 S19 辽宁本溪 山坡林缘 S29 河北易县 山坡林下 S10 黑龙江佳木斯 山坡路旁 S20 辽宁清源 路边草丛 S30 河北遵化 路边草丛 2.方法与结果 2.1 色谱条件 AgilentTC-C18 色谱柱 (250mm*4.6mm)； 流动相 ： A-甲醇 ,B-0.4%磷酸水溶液 ， 梯度洗脱程序 :023min， 14%16%A； 2327min， 16%50%A； 2742min， 50%57%A； 4255min， 57%A； 流速 ：0.8mL min-1； 检 测波长 ：采用 切换波长 ,(023min)波长 270nm， (2355min)波长 370nm； 柱温

14、： 30 ；进样量 ： 10L。 在此色谱条件下 没食子酸 ,原儿茶酸 ， 槲皮素 ,山奈素 ,山奈素 -3,7-O- -二鼠李糖苷的 分离度均大于 1.5，拖 尾因子在 0.95-1.05 之间，分离度良好（图 1）。 A： 混合对照品； B： 鼠掌老鹳草 样品； 1.没食子酸 2.原儿茶酸 3.槲皮素 4.山奈素 -3,7-O- -二鼠李糖苷 5.山奈素 图 1 对照品及样品 HPLC 色谱图 Fig.1 High performance liquid chromatogram of reference substance and samples - 2.2 对照品溶液的制备： 精密称取

15、各对照品 没食子酸 ,原儿茶酸 ， 槲皮素 ,山奈素 ,山奈素 -3,7-O- -二鼠李糖苷 各 4.81mg, 5.01mg, 4.92mg, 5.1m5g, 5.01mg，分别置于 50ml 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀。再精密量取 没食子酸 ，原儿茶酸，槲皮素，山奈素， 山奈素 -3,7-O- -二鼠李糖苷 各 2ml 分别于 25ml容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，制成 没食子酸 ,原儿茶酸 ， 槲皮素 ,山奈素 ,山奈素 -3,7-O- -二鼠李糖苷的 每 1ml 含 0.09620mg， 0.008016mg， 0.007878mg， 0.008240mg和 0.1002mg 的单

16、一成分对照品溶液备用。精密称取上述对照 品溶液适量制成混合对照品，至于 -4 冰箱中待用。 2.3 供试品溶液的制备： 精密称定鼠掌老鹳草药材 粉末 2g， 加石油醚脱脂 1h,弃去 石油醚，残渣加 30 倍80%的乙醇，回流提取 3 次， 每次 1h， 过滤， 合并 滤液，浓缩并用 甲醇 定容 至 25ml 容量瓶中，作为供试品溶液备用。 2.4 线性关系考察： 精密量取 不同质量浓度的混合对照品溶液，进样分析，用外标法定量。将各对照品 的浓度作为横坐标， 峰面积 作 为纵坐标， 进行线性 回归 得标准曲线方程和线性范围 ，见表 2。 表 2 5 种成分的线性关系 Tab.2 Linear

17、relationship of 5 components 对照品 线性方程 /g.L-1 线性范围 /g.L-1 r 没食子酸 Y=2640.6X+391.35 0.19241.7316 0.9997 原儿茶酸 Y=2358X+2.6647 0.01600.2561 0.9999 槲皮素 Y=4730X+2.0451 0.00390.0393 0.9999 山奈素 Y=4354.6X+2.3679 0.00410.0412 0.9999 山奈素 -3,7-O- - 二鼠李糖苷 Y=1780.7X-146.35 0.20041.6032 0.9998 2.5 精密度试验 ： 精密量取混合对照品溶

18、液，在上述色谱条件下，连续进样 6 次，分别测定峰面积。 没食子酸 、 原儿茶酸 、 槲皮素 、 山奈素 、 山奈素 -3,7-O- -二鼠李糖苷 峰面积 的 RSD 分别为 1.4%， 2.2%， 0.8%，1.7%和 2.1%； 表明仪器 精密度良好 （ n=6） 。 2.6 重复性试验 ： 精密称 取混合均匀的药材粉末 6 份 ， 按 2.3 供试品溶液制备项下方法操作，在 2.1 色谱条件下进行分析测定，计算 没食子酸 、 原儿茶酸 、 槲皮素 、 山奈素 、 山奈素 -3,7-O- -二鼠李糖苷 峰 含量的 RSD 分别为 1.9%， 2.1%， 1.7%， 1.1%和 2.4%。表

19、明该方法重复性良好 （ n=6） 。 2.7 稳定性考察 ： 精密吸 取 供试品溶液 ， 室温 下放置，分别于 0， 2， 4， 6， 8， 10， 12， 24h 测定， 分别 记录峰面积， 没食子酸 、 原儿茶酸 、 槲皮素 、 山奈素 、 山奈素 -3,7-O- -二鼠李糖苷 峰面积 的 RSD 分别为 1.6%， 0.9%， 1.8%， 1.7%， 2.1%和 2.0%， 结果表明，供试品溶液在 24h 内稳定性良好， 。 2.8 回收率 试验 ： 精密称定已知准确含量的 鼠掌老鹳草 药材粉末 0.5g 共 9 份， 3 份为一组， 每组按低，中，高浓度分别精密加入 没食子酸 ,原儿茶

20、酸 ， 槲皮素 ,山奈素 ,山奈素 -3,7-O- -二鼠李糖苷 的 对照品 ，按 2.3 供试品溶液制备项下方法操作，在上述色谱 条件下 进行分析 ， 计算回收率 得 没食子酸 、 原儿茶酸 、槲皮素 、 山奈素 、 山奈素 -3,7-O- -二鼠李糖苷 的平均回收率分别为 100.07%、 99.55%、 100.28%、 99.99%和 99.90%， RSD 的平均值 分别为 1.5%、 1.7%、 2.2%、 1.8%和 1.0%（ n=3）， 说明该方法准确率高 ，结果见表 3。 - 表 3 5 种对照品加样回收率（ n=3） Ta b.3 The results of recov

21、ery test（ n=3） 成分 原有量 / g 加入量 / g 测得值 / g 回收率 /% 平均 值 /% RSD/% 平均值 /% 没食子酸 1586.10 1269.44 2854.71 99.930 99.93 1.1 1.5 1586.08 3174.26 100.13 1.5 1900.10 3491.38 100.27 1.8 原儿茶酸 130.650 103.620 232.480 98.270 98.27 2.1 1.7 130.640 261.840 100.42 1.2 156.140 286.160 99.590 1.7 槲皮素 105.560 84.4600 19

22、0.320 100.35 100.07 2.0 2.2 105.590 212.060 100.86 2.3 126.670 230.960 98.990 2.3 山奈素 167.650 134.220 302.150 100.21 99.92 1.9 1.8 167.640 335.370 100.05 2.5 201.180 367.850 99.510 1.0 山奈素 -3, 7-O- -二 鼠李糖苷 1287.62 1030.26 2315.66 99.630 99.63 0.6 1.0 1287.48 2578.32 100.25 1.1 1542.22 2825.04 99.680

23、 1.2 2.9 不同产地样品的含量测定： 分别精密称取 30 个 不同产地的药材粉末 各 2g,按照供试品溶液的制备 方法操作 ,分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 10L,注入高效液相色 谱仪 , 在上述色谱条件下进行分 析 测定 ,即得 (表 4)。 表 4 不同产地鼠掌老鹳草 5 种成分含量的质量份数 (n=3) mg.g-1 Tab.4 5 kinds of quality ingredients of shares in different sources of Geranium sibiricum L. (n=3) mg.g-1 NO. 产地 没食子酸 原儿茶酸 槲皮素 山奈素

24、 山奈素 -3, 7-O- -二 鼠李糖苷 S1 吉林通化 1.139 0.052 0.085 0.131 0.914 S2 吉林梅河口 1.587 0.130 0.922 0.157 1.288 S3 吉林磐山 1.438 0.141 0.118 0.224 0.797 S4 吉林市 0.092 0.057 0.095 0.135 0.710 S5 吉林敦化 0.813 0.232 0.233 0.141 1.062 S6 吉林安图 0.983 0.087 0.147 0.309 0.706 S7 黑龙江穆棱 1.147 0.139 0.128 0.260 0.764 S8 黑龙江鸡西 1.

25、231 0.120 0.225 0.144 1.101 S9 黑龙江七台河 1.545 0.064 0.112 0.253 1.453 S10 黑龙江佳木斯 1.963 0.108 0.120 0.153 0.972 S11 黑龙江伊春 2.229 0.261 0.211 0.335 0.802 S12 黑龙江哈尔滨 1.756 0.132 0.223 0.148 0.947 S13 辽宁铁岭 1.594 0.134 0.112 0.227 0.584 S14 辽宁鞍山 0.768 0.115 0.120 0.212 0.625 S15 辽宁大连 0.825 0.058 0.210 0.121

26、 1.185 S16 辽宁丹东 2.134 0.148 0.117 0.242 0.355 - S17 辽宁葫芦岛 0.478 0.146 0.226 0.119 0.702 S18 辽宁锦州 0.445 0.042 0.112 0.131 0.359 S19 辽宁本溪 1.011 0.124 0.115 0.147 0.661 S20 辽宁清源 0.309 0.053 0.067 0.261 0.585 S21 辽 宁海城 0.808 0.155 0.223 0.136 0.661 S22 辽宁沈阳 1.323 0.140 0.226 0.241 0.794 S23 辽宁锦州 0.773 0

27、.059 0.138 0.176 1.498 S24 北京香山 0.812 0.158 0.228 0.288 1.263 S25 天津蓟县 1.815 0.104 0.127 0.134 1.200 S26 山东崂山 1.813 0.169 0.212 0.215 0.381 S27 山东泰山 1.139 0.052 0.125 0.059 1.481 S28 河北承德 1.628 0.135 0.213 0.156 0.577 S29 河北易县 0.678 0.097 0.122 0.167 0.828 S30 河北遵化 1.714 0.267 0.136 0.207 1.736 3 讨论

28、 3.1 提取方法的选择 : 通过对提取方式 (超声、冷浸、热回流提取 )的考察 ，发现超声与冷浸的提取效果相当，但所得色谱图的总峰面积远小于热回流提取所得色谱图的总峰面积 ,故选择乙醇加热回流的方法 。 3.2 提取工艺的优化 : 本 文在 单因素考察的基础上优化了提取工艺， 通过正交试验 ，确定了 优化 提取 工艺条件为： 30倍 80%的乙醇提取 3次，每次 1h。工艺验证 性 试验表明， 其工艺的平均提取 率 较高。因此 所筛选出来的工艺合理可行，稳定可靠 ，节省物料 ，具有 很好的 可操作性和重复性 。 3.3 色谱条件的选择： 分别用甲醇一水、乙腈一水、 甲醇 一磷酸盐缓冲体系为流

29、动相，以不同梯度进行试验，结果表明用甲醇一 磷酸 水线性梯度洗脱效果最好。 同时试验了不同的 检测波长 ,发现前面 两种有机酸类 成分 的最大吸收波长在 270nm左右，而后面三种黄酮类 成分 的最大吸收波长在 370nm左右 ，无法实现同一波长下 5种成分的同时检测，故 选择切换波长的方法，使图谱所含的信息量最大， 且各色谱峰分离较好 ，峰面积较大。选择在 23min切换是因为原儿茶酸和没食子酸已经出峰，而后面三种黄酮类化合物还没有出峰；而且此时切换前后的基线仍较平稳。 实验证明所建立的 HPLC含量测定的方法 操作性强，重现性好，可作为 该药材含量测定的检测方法 。 4 结 论 本实验采用

30、高效液相色谱法对 30个不同产地鼠掌老鹳草中 5种活性 成分 进行了 定量分析 ，结果表明 5种活性成分的含量差异明显，因此在入药时，应充分考虑产地因素 ；同时也表明控制药 材质量的重要性 。 本研究对 我国北方 地区的野生 鼠掌老鹳草 资源进行了较为全面的野外实地考察 ,首次进行了系统的采集、分析 , 30批样品基源、生境明确 ,5种活性成分的含量分析为本地区 该药材 资源 的进一步 开发利用提供了一定的参考依据。 同时 ,本 实验通过对色谱条件的优化 ， 使 药材中 5种活性成分 达到了良好的分离 ； 测定结果表明所建立的 鼠掌老鹳草 中 没食子酸 、 原儿茶酸 、 槲皮素 、 山奈素 、

31、 山奈素 -3,7-O- -二鼠李糖苷 5种活性成分的 HPLC含量测定方法 ,操作简便 ,结果准确、稳定 ,且重复性好 ,为 该药材的 含量分析、品质评价及质量标准的 建立提供了简便、准确、快速、有效的分析方法 ，也为老鹳草类药材的 开发提供 了一定的指导作用 。 参考文献 1中华人民共和国卫生部药典委员会编中华人民共和国药典一部北京：化学工业出版社， 2005： 263 - 2刘娟，等老鹳草的本草考证中草药 ， 1992， 23(5)： 276. 3周海燕 .老鹳草的研究概况 .国外医药 植物药分册， 1996， 11（ 4）： 164. 4杜晓鸣老鹳草素及其抗氧化作用 J国外医药植物药分

32、册 1990， (2)： 57 5韩公羽，沈企华 .植物药有效成分的研究与开 发 M.杭州：杭州大学出版社， 1991， 94. 6李荣芷，李霞，何为江 .中草药中抗 HBV多元酚类活性成分的研究 J.北京医科大学学报， 1994， 26（ 2）：134. 作者简介： 罗宏 (1985-)，辽宁 铁岭 人，硕士研究生，主要研究方向： 种质资源鉴定及中药的品质评价 。 通讯作者： 尹海波 (1973-)，辽宁沈阳人，副教授，硕士研究生导师，主要研究方向：种质资源鉴定及中药的品质评价； Tel： 15998530628， 0411-87586003； 。 基金项目： 辽宁省教育厅项目 (2009A498)