木质素的遗传操纵减少了内在反抗以及提高柳枝稷的乙醇生产能力.docx

1、木质素的遗传改造以减少了顽抗以及提高柳枝稷的乙醇生产能力摘录 柳枝稷在美国是一种先进的生物能源原料，因为它是一种本地的、高产的、常年有的、具有广泛的种植范围以及低农艺输入要求。生物质转化的研究开发以及工艺生产乙醇和其他生物燃料，但它们仍然昂贵，这主要是因为生物质的固有顽抗。我们在这里展示的柳枝稷能产生遗传修饰的表型正常的植物，减少了热化学（180C），酶和微生物的顽抗。柳枝咖啡酸 O-甲基转移酶基因的下调温和降低木质素含量，降低紫丁香：愈创木基木质素单体比，提高饲料质量。并且，最重要的是，增加乙醇产量提高到 38，使用传统的生物质发酵过程。降低要求不太重要的预处理和用量相当于产品产量低 300

2、-400的纤维素酶同步糖化发酵用酵母。此外，使用不添加酶的嗜热梭菌发酵稀酸预处理转基因比未修改柳枝稷表现出更好的产品产量。因此，转基因柳枝稷固有顽抗明显的减少，可能生物质发酵衍生的燃料和化学品的加工费用也明显降低。另外，这种修饰的转基因柳枝稷线应在相同的工艺条件下，每公顷产量显着更多的化学品。木质纤维素生物质是丰富的，可再生的原料，可以通过发酵转化为可运输的液体燃料和其他化学品。纤维素乙醇是一种很有前途的短期技术选项，以减少运输部门的温室气体排放量。由于木质纤维素生物质是由纤维素，半纤维素和木质素等构成，例如原料是高度顽抗淀粉相比，其转化为乙醇的碳水化合物的生物转化。当前生物质发酵过程作为燃料

3、和化学品有相对较高的成本主要是由于这种顽抗，进而限制了商业化的生物质乙醇。为了实现可持续的能源生产，必须克服化学和结构性能的生物质，抑制其解构在专用的生物能源作物上。木质生物质转化乙醇是一个三步的过程，涉及预处理，其次是多糖水解单糖其次是糖发酵乙醇。存在木质素在细胞壁负面影响这些转换步骤。实验自然变异在紫花苜蓿、柳枝稷和高粱小子虉草，表明降低木质素含量提高体外酶水解。木质素改性途径在苜蓿转基因线生成增加酶糖释放与木质素下调基本上成正比的程度。尽管转基因的方法已经被用来描述木质素生物合成途径和提高细胞壁的特征，大多数的研究已经进行了与双子叶植物物种在上下文的合成饲料和纸制浆，只有有限的信息可用于

4、多年生单子叶植物。迄今为止，还没有报告关于发酵的改良植物乙醇生产在任何转基因多年生生物燃料作物。柳枝稷（ Panicum virgatum L。）是由美国能源部确定一个专门的能源作物。它是原产于美国，是一个常年生产的 C4 植物，具有广泛的种植范围，需要相对较少的作为一种生物燃料作物的农艺输入。实地研究表明，柳枝稷的种植和管理作为生物质作物在它的生产时比它消耗的能量多产生 540的可再生能源的能量，并具有显着的环境效益。柳枝稷的遗传改良，以减少内在顽抗发酵生物加工将提高生物燃料和化工生产过程和对新生的生物能源行业产生深远的积极的影响。我们在这里展示咖啡酸 3 - O-甲基转移酶 （COMT）基

5、因中的木质素途径下调导致代转基因柳枝植物正常生长型，降低木质素含量，改变木质素组成，提高饲草质量与对照组相比，糖化效率增加，在基板上的乙醇生产产量增加。此外，转基因植物材料要求不太高的预处理和纤维素酶剂量低得多获得乙醇产量相当于对照的产量。这些转基因柳枝稷的线条和方法是有价值的对于发展生物燃料作物的品种改良。结果柳枝 COMT 基因调控在紫花苜蓿和其他物种的早期成果的基础上的木质素改性，我们选择调控 COMT基因柳枝使用广泛分布的各种“Alamo”2 个月，我们构建了 cDNA 文库老柳枝苗和孤立一个 COMT 的基因包含一个 1，086 bp 的 ORF。部分序列的 ORF 被用来构建 RN

6、Ai 载体转入农杆菌菌株 EHA105，通过农杆菌介导的胚性愈伤组织，获得转基因柳枝植物。 RT-PCR 和实时定量 PCR 分析所选的转基因植物显示在(图1 A and B)大多数的线条上，减少 90以上观察到的线条 T0-2 和 T0-3 转录显着降低（ 图 1 中 ）（ 图 1B ）。 ，以确定是否转移酶转录降低导致的 COMT酶的活性，减少粗酶提取物制备的转基因和对照植株检测与两个优选的转移酶的底物，5-OH coniferaldehyde 和 caffeyl 醛（ 图 1 C ）。除线 T0-9，所有的转基因植物显示 COMT 酶的活性显着降低。最强烈的下调线，T0-2 和 T0-3

7、，有 22-25和 25-28的残留酶活性，分别根据所用基片（ 图 1 C ）。 T0 线T0-2，T0-3，和适度下调线 T0-12 被选择用于进一步分析。由于异交要求柳枝稷，这些线路与野生型植物远缘杂交，取得指定为 T1 线路的后代种子。这两种COMT RNAi 的阳性和阴性（分离子空）确定从每个交叉的后代植物，使用负的植物作为对照进行分析，对应于 T1 的转基因植物。COMT 抑制木质素含量、成分和植物生长的影响我们研究木质素含量和木质素单体组成在整个分蘖（包括茎，叶，鞘）和来源于转基因柳枝稷。在 T0 代转基因株系 T0-2，T0-3，和 T0-12 表明乙酰溴（ACBR）木素含量显着

8、降低（12。2T0-2，T0-3 14。7，及 6。4为 T0-12），紫丁香（S）和愈创木基（G）的的木质素单体含量，S / G 的比值为全分蘖（ 表 1 ）。与野生型植物异花授粉后，即使 T1 代的两个最下调线，T1-2和 T1-3，显示减少两个 ACBR 木质素，在 11。4-13。4，和 S 和 G 木质素含量类似于在各自的 T0 线看到的减少。将所得的 S / G 的比值是在 T1 和 T0 线基本上是相同的，为 0。37-0。40，而对照组（ 表 1 ） 0。69-0。71 。干材料中的木质素含量和较高的 S / G 的比值（ 表 S1 ）有相似水平的减少。复杂细胞壁多糖的组合物，进行评价，以确定潜在的更广泛影响 COMT 下调。 T0 和 T1 线展出纤维素水平的微小变化，在-3至-5，与对照组相比（ 表 S2 ）为 T0 线和+3T1 线路。纤维素的结晶度指数（CRI）和聚合度（DP）的 T1-2和 T1-3 线基本上是相同的对照组（ S1 图 A 和 B ） 。同样，T0 和 T1 转基因株系的茎材料显示-1+3的纤维素含量的变化与对照组相比（ 表 S3 ） 。显然，降低木质素含量有轻微或微不足道的影响纤维素内容或结构。