1、实验十四 碱性磷酸酶米氏常数的测定,一、目的要求,1.学习分光光度法测定的原理和方法2.学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度（Vm）的测定原理和方法，测出碱性磷酸酶在以对硝基苯酚磷酸为底物时的Km 和Vm值。,二、原理,酶促反应v-S曲线 v S推导出米氏方程为：其中S为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度；Km 为米氏常数,米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。测定Km和Vm，可通过作图法求得。 最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将
2、米氏方程转化为倒数形式，即：以1/v对1/S作图，可得一条直线,1/v 1/Vm -1/Km 1/S本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)水解的Km和Vm.反应式：pNPP+H2O pNP+HPO42- 无色 黄色 可通过分光光度法测定产物pNP的含量，求出反应速度v。,三、试剂与器材试剂： 0.5mol/mL pNP 、10 mmol/L pNPP、20 mmol/L MgCl2、0.1 mol/L 碳酸钠碳酸氢钠 pH 10.1缓冲液、0.2 mol/L NaOH、6 mg/mL碱性磷酸酶酶液器材：恒温水浴锅、722分光光度计,四、操作方法,（一）对硝基苯酚标准曲线的制作（不
3、做） 取5支试管编号,0号一支,17号各二支,按下表操作： 管 号 0 1 2 3 4 5 6 pNP含量 (mol) 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.5mol/mL pNP (mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 H2O (mL) 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 Na2CO3-NaHCO3 (mL) 各管加入1.0 mL 20 mmol/L MgCl2 (mL) 各管加入0.2 mL 0.2 mol/L NaOH (mL) 各管加入2.0 mL OD 405 nm以对硝基苯酚的绝对量(mol数)为横坐标，OD4
4、05nm值为纵坐标，绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数()值。,(二）测定15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照。No. 1 2 3 4 5底物终浓度S (mmol/L ) 0.5 0.75 1.0 1.5 310 mmol/L pNPP（mL ） 0.1 0.15 0.2 0.3 0.6蒸馏水（mL ） 0.6 0.55 0.5 0.4 0.1 碳酸盐缓冲液（mL ） 各加1.0 mL 20 mmol/L MgCl2 （mL ） 各加0.2 mL 预热 混匀，37，5分钟酶液（mL ） 测定管各加0.1 mL酶液 反应时间 37，精确反应10分钟0.2mol/L NaOH（mL） 各加2 mL 酶液（mL ） 空白管各补加0.1 mL酶液 OD405分别以01-05调零点，测定对应样品管OD405。,（三） 数据处理 各管在722分光光度计测定波长405nm的OD值(OD405nm)。从对硝基苯酚标准曲线上查出OD405nm相当于产物对硝基苯酚的含量，计算出各种底物浓度下的初速度vo（单位以molL-1min-1表示），取倒数1/v填入表内。以1/v对1/S作图，求出酶催化pNPP水解的米氏常数Km和最大反应速度Vm。,六、思考题(1)试说明米氏常数Km的物理意义和生物学意义。(2)为什么说米氏常数Km是酶的一个特征常数而Vm则不是？,
