浅谈HPLC法检测咸鸭蛋中非法添加苏丹红染料.doc

1、1浅谈 HPLC 法检测咸鸭蛋中非法添加苏丹红染料杨沫银内蒙古食品药品检验所（010020）摘要：目的：完善检测方法，更好的监控非法添加物。方法：采用高效液相色谱法，改变提取溶剂。结果：苏丹红、分别在 0g/ml2.56g/ml 范围呈良好线性关系，回收率在 66%80%之间，方法最低检出限在 3.3g/Kg7.5g/Kg（按蛋总重计算）之间。结论：方法简便，结果准确。关键词：咸鸭蛋 高效液相色谱法 苏丹红Abstract Objective: To perfect the method of measure method, Better monitoring of illegal addit

2、ives. Method: Adopt HPLC to change the solvent extraction. Results: the calibration curve showed a good linearity with the range of 0g/ml -2.56g/ml for sudan , the range of recovery was 66%-80%, the limit of detection was 3.3g/kg-7.5g/kg (According to calculation of the total egg). Conclusion: the m

3、ethed is simple and the result is accurate.苏丹红属于化工染料，有、号四种。据文献报道 1，该物质具有偶氮结构，对人体的肝、肾器官有明显的毒副作用。经毒理学研究表明，苏丹红具有致突变性和致癌性，国家明令禁止添加于食品中。本方法参照相关文献 2，将其提取方法进行了修订，改进后的方法具有分离效果好、灵敏、准确等优点。1.样品来源：市售。2.仪器与试药：2.1 仪器 美国安捷仑-1100 高效液相色谱仪，紫外-可见检测器，离心机，旋转蒸发仪等。2.2 试剂 乙睛、丙酮、甲酸、为色谱纯，水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。2.3 对照品 苏丹红由 D-86199

4、Augsburg,Gemany 提供 苏丹红、苏丹红、苏丹红、苏丹红纯度85%。2.4 层析用氧化铝（中性 100 目200 目）：105干燥 2h，于干燥器中冷却至室温，每 100g 中加入 2ml 水降活，混匀密封，放置 12h 后使用。2.5 氧化铝层析柱：在层析柱管（1cm5cm 的注射器管）底部塞入一薄层脱脂棉，干法装入处理过的氧化铝至 3cm 高，轻敲实后加一薄层脱脂棉，用 10ml 正己烷预淋洗，洗净柱中杂质后，备用。23.色谱条件：3.1 色谱柱：Agilent ZORBAX SB- C18 3.5m 4.6mm150mm3.2 流动相： A：0.1%甲酸的水溶液乙睛 （851

5、5）B：0.1%甲酸的乙睛溶液丙酮（ 8020）流速：1ml/min；柱温：30；检测波长 478nm；进样量：10l。梯度条件见表 1表 1 梯度条件流动相时间（min）A% B%0 25 7510.0 25 7525.0 0 10032.0 0 10035.0 25 7540.0 25 754.方法学考察4.1 溶液制备4.1.1 对照品溶液的制备 分别精密称取苏丹红、苏丹红、苏丹红、苏丹红各 10.0mg（按实际含量折算） ，置 250ml 量瓶中，加乙醚溶适量使溶解，加正己烷稀释至刻度，摇匀，作为标准储备液。精密吸取标准储备液0.0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6ml，置 25

6、ml 量瓶中，加丙酮稀释至刻度，即得。此标准系列浓度为 0、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56g/ml 。4.1.2 供试品溶液的制备 称取粉碎样品 2g4g（准确至 0.01g） ，置 50ml 离心管中，加入水 3m，l 匀浆 1min 将其分散成糊状，加入正己烷丙酮（31）6ml，充分匀浆 5min，3000rpm 离心 10min，吸出正己烷液，于下层再加入次正己烷（4ml、4ml） ，匀浆，离心，合并 3 次正己烷液，加入无水硫酸钠 1g 脱水，滤过，滤液置旋转蒸发仪蒸干并保持 5 分钟，用正己烷溶解并缓缓转移至已处理氧化铝层析柱上，用正己烷少量多次冲洗浓缩瓶，一并注入

7、层析柱，用 40ml 正己烷洗脱至流出液无色，蒸干，残渣用丙酮适量使溶解并定容至 2ml，过微孔滤膜（0.45m） ，即得。34.2 含量计算 按公式（1）计算苏丹红含量 CVR = （1）MR：样品中苏丹红含量，单位为 mg/Kg；C：由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度，单位为 g/ml；V：样液定容体积，单位为 m l；M：样品质量，单位为 g。4.3 线性关系的考察分别精密称取苏丹红、苏丹红、苏丹红、苏丹红各 10 mg（按实际含量折算） ，置 250ml 量瓶中，加乙醚适量使溶解，加正己烷稀释至刻度，摇匀。精密吸取0ml、0.1ml、0.2 ml、0.4 ml、0.8 ml、1.6ml

8、，置 25ml 量瓶中，加丙酮稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取 10l 进样，按上述色谱条件测定。以峰面积对进样量进行回归分析，绘制标准曲线。结果见表 2表 2 标准曲线测定结果序 号 1 2 3 4 5 6苏丹红浓度（g/ml） 0 0.1608 0.3216 0.6433 1.2867 2.5735峰面积积分值平均值 0 7.00485 14.21628 28.25115 54.9508 110.3807回归方程（苏丹红） y=42.78x+0.2488 r=0.9999苏丹红浓度（g/ml） 0 0.1671 0.3342 0.6684 1.3368 2.6736峰面积积分值平均值 0 7

9、.0934 14.10284 29.97735 58.42848 117.8936回归方程（苏丹红） y=44.132x-0.1852 r=0.9999苏丹红浓度（g/ml） 0 0.1599 0.3198 0.6396 1.2792 2.5585峰面积积分值平均值 0 6.783685 13.03387 27.85217 54.41752 110.2893回归方程（苏丹红） y=43.122x-0.2311 r=0.9999苏丹红浓度（g/ml） 0 0.1609 0.3218 0.6436 1.2872 2.5745峰面积积分值平均值 0 5.946615 11.76104 24.9113

10、 48.44117 99.15771回归方程（苏丹红） y=38.504x-0.3077 r=0.999944.4 回收率试验取已知不含添加剂的空白样品 2 份，分别精密加入苏丹红对照品适量，按拟订的含量测定方法制备供试品溶液，测定每份样品中苏丹红的含量，计算回收率。结果见表 3表 3 回收率试验结果编号 取样量（g） 对照品加入量（g） 样品含量（g）回收率（%）苏丹红 1.2867 0.9173 71.28苏丹红 1.3368 0.9890 73.98苏丹红 1.2792 0.8536 66.721苏丹红2.3111.2872 1.0326 80.21苏丹红 1.2867 0.9982 7

11、7.57苏丹红 1.3368 0.9688 72.47苏丹红 1.2792 0.8881 69.422苏丹红2.8811.2872 1.0057 78.134.5 方法最低检出限试验取已知不含添加剂的空白样品，分别精密加入苏丹红对照品适量，按拟订的含量测定方法制备供试品溶液，测定每份样品中苏丹红的含量，计算最低检出限。结果见表 4表 4 最低检出限测定结果苏丹红 苏丹红 苏丹红 苏丹红按总蛋重计算（g/Kg）3.3 7.1 7.1 7.5按蛋黄重计算（g/Kg）9.4 20.4 20.4 21.55.实验结果在选定的条件下，苏丹红（、）与样品中其他组分色谱峰可基线分5离，分离度均大于 1.5，

12、且苏丹红、苏丹红、苏丹红、苏丹红色谱峰之间基线分离，分离度均大于 1.5；按苏丹红（、）峰计算，理论板数（N）均在10000 以上。对照品、供试品、加样回收试验、最低检出限试验的 HPLC 图谱见图14。6.讨论6.1 层析用氧化铝活化程度的考察 不同厂家和不同批号氧化铝的活度有差异，须根据具体购置的氧化铝产品略作调整，活度的调整采用标准溶液过柱，将 1g/ml 的苏丹红的混合标准溶液 1ml 加到柱中，用 5%丙酮正己烷溶液 60ml 完全洗脱，4 种苏丹红在层析柱上的流出顺序为苏丹红、苏丹红、苏丹红、苏丹红，可根据每种苏丹红的回收率作出判断。苏丹红、苏丹红的回收率较低表明氧化铝活性偏低，苏

13、丹红的回收率偏低时表明活性偏高。为保证层析效果，在柱中保持正己烷液面为2mm 左右时上样，在全程的层析过程中不应使柱干涸，控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于 0.5cm。6.2 溶解对照品溶剂的考察：文献 2中，对照品用乙醚溶解后，用正己烷定容，其中苏丹红、苏丹红、苏丹红色谱峰峰形较好，但苏丹红色谱峰峰形较差，改用丙酮定容后，苏丹红、苏丹红、苏丹红、苏丹红色谱峰峰形均较好，理论板数均达到 10000 以上，故确定对照品定容溶剂为丙酮。6.3 提取方法的考察：采用欧洲标准 3方法，加样回收试验中，杂质峰较多，对照品色谱峰与样品中其他组分色谱峰不能基线分离，故未采用其方法；文献 2中，在洗脱样品时

14、采用 10ml30ml 正己烷淋洗氧化铝层析柱，直至流出液无色。弃去全部正己烷淋洗液，用含 5%丙酮的正己烷液 60ml 洗脱，收集、浓缩后，用丙酮转移并定容至5ml，经 0.45m 有机滤膜过滤后待测。但实际加样回收试验中发现正己烷淋洗液中含有绝大部分对照品，而含 5%丙酮的正己烷洗脱液中几乎无对照品，故将方法改为：在洗脱样品时用约 40ml 正己烷洗脱氧化铝层析柱，直至流出液无色，收集、蒸干后，用丙酮转移并定容至 2ml，经 0.45m 有机滤膜过滤后待测，加样回收试验结果为回收率在 66%80%之间，结果较好，采用改进方法。6参 考 文 献1 夏宁 苏丹红的种类及其对人类的危害 内肛科技 2005 年第四期 2 中华人民共和国国家标准 GB/T1961-20053 欧洲健康与消费者保护综合委员会第四分委员会生产与流通环节的食品安全第三部 物理化学危害监督 新方法声明：03/99（辣椒粉以及辣椒为主要成分的产品中苏丹红和胭脂树橙的含量分析）图 1 苏丹红对照品色谱图图 2 供试品色谱图7图 3 加样回收试验色谱图图 4 最低检出限试验色谱图