雌激素受体ER免疫组化试剂盒.DOC

1、雌激素受体 （ ER） 免 疫 组化试 剂盒 该试剂盒以 HRP 标记 的 链霉亲和素复合物（ HRP Streptavidin Conjugate， HRP-SA） 为基础 ， 可 用 于检测细胞 、 组织内 的 特异性雌激素受 体 （ ER） 抗原 。 该 试剂盒具有灵敏度高 、 特异性强 、 定性定位准确 、 背景清晰 。 在所用的雌激素受 体 （ ER） 一抗与相应靶抗原结合后 ， 用生物化二抗与一抗特异性结合 ， 最后加入 HRP-SA， 形 成抗 原 特 异一 抗 生 物 素化 二抗 HRP-SA 复 合物 ，显 微镜 下 观察 成像。 试剂 盒 所含试剂： 试剂 A 通透液： 0

2、.1% Triton-X 100 10 mL（选用） 试剂 B 2 瓶封闭缓冲液（封闭用） 10 mL/瓶 试剂 C （原装进口分装）已稀释的即用型雌激素受体（ ER）一抗（ 2.5ml） 试剂 D （原装进口分装）生物素化羊抗兔 IgG 1 支 （浓度 1.5 mg/mL，稀释比为 1:3001:500） 50 L+抗体稀释液 20ml 试剂 E HRP-SA 复合物 1 支（浓度 1 M，稀释比 1:501:200） 100 L 试剂 F DAB 显色液 5ml 用户 自 备试剂： 雌激素受体（ ER） 1 10mM TBS（ pH7.27.4） 三羟基氨基甲烷 1.21g 氯化钠 7.6

3、g 加蒸馏水 800mL，浓盐酸调 pH 值至 7.27.4，最后定容至 1000mL TBS-T： TBS+Tween 20（ 0.05%体积比） 2抗原修复液（依检测抗原不同而选择不同的修复液） 10mM pH6.0 柠檬酸缓冲液 柠檬酸 0.38g 柠檬酸三钠 2.45g 加蒸馏水 900mL，浓盐酸调 pH 值至 6.0，最后定容至 1000mL 或： 0.5M EDTA 修复液（ pH8.0） EDTA 2H2O 186.1g 雌激素受体（ ER） 柠檬酸三钠 2.45g 加蒸馏水 700mL，用 10mM NaOH 调 pH 值至 8.0，最后定容至 1000Ml 3. 缓冲甘油封

4、固剂 10 mL 4. Tween 20 5 mL 石蜡 包 埋组织切片免疫 染 色 实验 步 骤（建议方 案 ） ： 石蜡包埋组织切片 34 m 厚度 1.烤片： 将待做切片置于切片架上，于 60恒温烤箱中至少烤 1 hr； 2.脱蜡： 切片放入盛有二甲苯的容器中脱蜡 3 次 （即二甲苯 、 、 ） ， 每次 10 min； 3.水化： 切片经下行酒精水 化 ， 无水乙醇 5min， 95%乙醇 2 次 （每次 2min） ， 85% 乙醇 2 min； 75%乙醇 2min，自来水冲洗， ddH2O 洗 2 2min； 4.抗原 修 复： 根据 抗 体说明 书 推荐 方 法进 行 抗原修

5、复 ，常 采 用高 压 、微波（温 度达到 98100 ） 或 酶 消化修复法 ， 室温自 然 冷却 ， 自来水冲洗 ， ddH2O 洗 2 2min， TBS 洗涤（ 2 2min） （具体修复方法见附 1） * 注：有些抗原勿需修复， 直接进入第 5 步封闭。 5.封闭： 滴加试剂 B， 37湿盒孵育 30 min； 6.加一抗：滴加用试剂 C（即用型一抗 ） ， 37湿盒孵育 2 hr 或 4过夜； 7.洗涤： TBS-T 洗涤（ 3 5 min） ； 雌激素受体（ ER） 8.封闭： 滴加试剂 B， 37湿盒孵育 10 min； 9.加二抗： 滴加用抗体稀释液稀释的生物素化二 抗 （试

6、剂 D） ， 37 湿盒中孵育 30 min； 10.洗涤： TBS-T 洗涤（ 3 5 min） ； 11.封闭： 滴加试剂 Tween 20， 37湿盒孵育封闭 20 min； 12.加 HRP-SA： 滴加用试剂 C 稀释的试剂 E（ 1： 50200，终浓度 520 nM） ， 37 湿盒中孵育 30 min； 13.洗涤： TBS-T 洗涤（ 3 5 min） ， TBS 洗涤（ 2 5 min） ； 14.显色：应用 DAB 溶液（试剂 F）显色； 15.复染：自来水充分冲洗，复染，脱水，透明； 16.封片： 待组织标本干后，用试剂缓冲甘油封固剂封片； 17.观察成像： 显微镜下观

7、察成像。 注意 事 项： 1. 修复 后 缓冲 液 须 自 然冷却 ， 自来 水 冲洗 后 方能把 切 片取 出 ，骤 冷 有可能导致 结晶或抗原封闭。 2. 缓冲 液 的量 必 须 保 证所有 切 片都 能 浸泡 到 ，用过 的 柠檬 酸 缓冲 液 不能反复使 用。 3. 若试剂为微量浓缩液 ， 用前应低速离心 ， 将内盖和管壁附着的溶液离到底部。 4. 封片前一定要换用 TBS 充分洗涤，以便洗去组织上残留的 Tween 20，否则会 影响结果观察。 5. 如须 复 染细 胞 核 ， 则在封 片 前复 染 或直 接 采用含 有 染核 试 剂的 封 片剂进行封 片。 附 1： 抗原 修复方法

8、 常用 抗 原修 复 液 ： 柠 檬 酸缓 冲 液（ 0.01M pH6.0） 、 EDTA 抗 原 修 复液 （ pH8.0 或 9.0）等等。 一、 酶 消化修复法 切片脱蜡水化处理， TBS 冲洗，在组织上滴 加 胃蛋白酶或胰蛋白酶 ， 37孵 育 2030min 后 TBS 冲洗即可。 二、 微 波抗原修复法 微波盒中加入抗原修复液微波加热至沸腾 ， 将脱蜡水化后的切片置于耐高温塑料 切片架 上 ， 放 入已 沸腾 的缓冲 液 中 ， 中档 或高 档继续 微 波 1015min，取出微波 盒冷却至室温后 ， 自来水冲洗 ， 取出切片 。 因 不同微波炉微波处理时间存在差异， 须自行调整

9、。 三、 直 接高压抗原修复法 取修复液于不锈钢高压锅中加热至沸腾 ， 将组织切片置于耐高温切片架上 ， 修复 液沸腾后放入切片架，盖上锅盖，待喷气后计时 1.52.5min 即可 脱 离热源，自 然冷却至室温后自来水冲洗 ， 取出切片 。 此方 法 适用于较难检 测或核抗原的修复。 四、 隔 水式高压抗原修 复 法 雌激素受体（ ER） 不锈钢高压锅中加自来水加热至沸腾 ， 微波盒中加入修复液于微波炉中加热至沸 腾，将切片放入微波 盒 中，再将微波盒放入 高 压锅中盖上锅盖，待 喷 气后 计 时 48 min 即可关闭热源，自然冷却至室温后自来水冲洗，取出切片。此方法适用 于较难检测或核抗原的修复。