RNA甲醛变性胶电泳.doc

1、RNA 甲醛变性胶电泳发布时间：11-10-28 来源： 科学实验仪器网 点击量：9312 字段选择：大 中 小RNA 甲醛变性胶电泳提取样品的总 RNA 后，一般根据 RNA 的凝胶电泳图来判断 RNA 的质量。由于 RNA 容易形成二级结构，因此常用甲醛变性胶来进行 RNA 电泳，得到的电泳图能真实反映 RNA 的质量状况一、试剂：DEPC（Sigma 公司产品），MOPs（Bocherigmer 公司产品），甲酰胺（Formamide，Sigma 公司产品），溴酚蓝（Bromphenol Blue，Sigma公司产品）。EDTA-Na2，氢氧化钠，醋酸钠，甲醛，甘油，分析纯，国产。RNA

2、 甲醛变性胶电泳二、试剂配制：1、DEPC 水的处理：用量筒量取去离子水 2L，在通风橱中，加入 2ml DEPC 到 2 升去离子水中，终浓度为 0.1%的 DEPC。迅速盖上盖子，混匀，然后放在摇床中中速摇荡至少 4hr，再高压灭菌。灭菌时将瓶盖松开，15 磅灭菌 20min。2、10 FA Buffer（formaldehyde agarose buffer：200 mM 的MOPs，50 mM 的 NaAc，10 mM 的 EDTA）：配制 500ml，称取 3.4g NaAC?3H2O 放入 1000ml 烧杯中，加入 400ml DEPC 处理过的去离子水，加入搅拌子，放在磁力搅拌

3、器上溶解。然后加入 20.9g MOPs，放在磁力搅拌器上溶解。再加 1.86g EDTA 二水二钠，放在磁力搅拌器上溶解。用 1M 灭过菌的 NaOH 调 PH 至 7.0（约用 NaOH 40ml），用 DEPC 处理过的去离子水定容至 500ml，装入棕色瓶中，写好标签，室温避光保存。4、5 甲醛变性胶加样缓冲液（5loading buffer）： 配制10ml。预先配制水饱和的溴酚蓝溶液：在 1.5ml 离心管中加入约0.1mg 溴酚蓝，加入 1ml DEPC 水溶解，充分振荡溶解，离心，可见离心管底部有溴酚蓝粉末剩余，上层液体即水饱和的溴酚蓝液。在 15ml灭菌离心管中，依次加入以下

4、各种成分：4.0ml 10 FA buffer3.1ml 甲酰胺2.0ml 100%的甘油720ul 37%的甲醛80ul0.5M 的 EDTA （PH 8.0）16ul 水饱和的溴酚蓝100ul DEPC 水混匀，分装，-20保存，常用放 4保存。5、1甲醛变性胶电泳缓冲液（1running buffer）：20 ml 10FA gel buffer，4.0 ml 37%的甲醛，176 ml 水，放入电泳槽中使用，一般在 3 次电泳结束后需更换此电泳缓冲液。6、1.2%的甲醛变性胶：称 0.4 克琼脂糖，加入 3.34 ml 10FA gel buffer，加入 30 ml DEPC 水，微

5、波炉融化，肉眼观察无颗粒状悬浮物。冷却至约 50-60，再加入 600 l 甲醛，倒入 7.55.0 cm 的凝胶模具中。插入合适长度和宽度的梳子，室温放置约 30min 后即可使用。RNA 甲醛变性胶电泳三、实验方法一般取 0.3 g 的总 RNA，加入 1/5 体积的 5加样缓冲液，65加热 5 min，冰上骤冷，以消除 RNA 的二级结构。建议上样前在 RNA 样品中加入 0.5-1.0 ul 的溴化乙锭（EtBr，浓度 1.0 mg/mL），而不在胶中加EtBr，这样电泳后的背景较低。配好的 1.2%的甲醛变性胶先在 1甲醛变性胶电泳缓冲液中预电泳 15min。RNA 样品在 5-10

6、 V/cm 的电压降下电泳 30min。图 1 是我们实验室用以上方法检测酵母总 RNA 的电泳图。图 1 酵母 total RNA 的甲醛变性胶电泳。1，酵母 total RNA（0.3 g）；2，酵母 total RNA（0.5 g）；3，RNA Marker（0.2 g）。RNA的质量判断标准是有清晰的 26S，18S 条带，无降解，且肉眼观察 26S条带亮度约是 18S 的 1-2 倍你这个问题我也遇到过，因为我要做 NORTHERN BLOT，所以前几个月一直摸方法。我的方法不和分子科隆上的完全一样，但肯定能得到很好的电泳图（我用手工提 RNA） 。我开始时跑胶后基本什么都没有，连降

7、解都没看见，应该和你的情况一样吧，呵呵！以下是我的PROTOCOL，你可以试试，我的电泳图就很漂亮，可惜我不会上传图！我觉得你用 EB 染应该没有问题，但你那方法我没有试过，你可以直接加在胶里啊！至于甲醛只要是新的没有必要去离子化，但是如果甲醛 PH 低于 4 的话，那就要处理一下，或换新的。方法：1配制 5X 甲醛凝胶电泳缓冲液： 5X 甲醛凝胶电泳缓冲液0.1mol/L MOPS(PH7.0)40mmol/L 乙酸钠5mmol/L EDTA(ph8.0)将 20.6g 丙磺酸（MOPS）溶于 800ml 经用处理 DEPC 的 50mmol/L 的乙酸钠溶液。用 2mol /L 氢氧化钠将

8、溶液的 ph 调至 7.0，加 10ml 经用 DEPC 处理的 0.5mol/LEDTA（ph8.0） ，再加经用 DEPC 处理的水至溶液总体积为 1L。上述溶液经用 0.2umol 微孔虑膜过滤除菌，比光保存于室温。光照或高压后溶液逐渐变黄，淡黄色的缓冲液可以正常使用，而深黄色缓冲液则不然。DEPC 有致癌之嫌，须小心操作！2制备凝胶：适量琼脂糖溶于 1X 甲醛电泳缓冲液（Ph6.97.0） ，至终浓度 1。微波炉溶解琼脂糖，然后冷却至 5060。将 37甲醛溶液（12.33mol/L ）加入凝胶溶液，至终浓度0.32mol/L，加两滴 EB（制胶盘约 30ml） ，混匀倒入制胶盘中，插

9、好梳子，让凝胶凝固 1h 后用。3在 EP 管中，将 RNA 样品（用高压灭菌水适当稀释）与等体积的加养缓冲液混合，总体机约为加养孔体积的 80。甲醛凝胶加样缓冲液：甲酰胺 0.75ml5x 甲醛凝胶加样缓冲液 0.30ml甲醛 0.24ml甘油 0.15ml1.2 溴酚蓝 0.05ml置-20保存。4将样品置沸水浴 24 分钟，然后置冰上冷却 2 分钟，使 RNA 变性，1200r/min 离心 5 秒，使液体全部沉积在 EP 管底。5加样前将凝胶预电泳 5 分钟，电压降为 5V/cm, 然后将样品加至凝胶加样孔。用已知大小的RNA 作为分子量标准参照物，如：18S 和 28SrRNA6将凝胶浸入 1X 甲醛凝胶电泳缓冲液中，34V/cm 电压降进行电泳。电泳缓冲液不需进行持续循环，电泳 12 小时后收集并混合两个液槽的缓冲液。（我配 30ml 胶大概加甲醛 700ul 左右，比分子克隆上少得多，但电泳以及转膜的效果都还可以）