DNA电泳常见问题分析.doc

1、DNA 电泳常见问题凝胶电泳操作注意事项1、 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响 DNA 的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。2、 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶化的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。3、 电泳缓冲液：为保持电泳所需的离子强度和 pH，应经常更新电泳缓冲液。4、 样品加入量：一般情况下，0.5cm 宽的梳子可加 0.5g 的 DNA 量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA 中片段的数量和大小而定.当加样孔大时,样品上样量应相应加大 ,否则会造成条带浅甚至辨认不清;反之则应适当

2、减少加样量，但是上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾或弥散，对于较大的 DNA 此现象更明显。5、 DNA 样品中盐浓度会影响 DNA 的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。6、 DNA 迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辩范围广泛的 DNA 分子，制备琼脂糖凝胶可根据 DNA 分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段 DNA 的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，以提高分辨率。7.选择的实验材料要新鲜，处理时间不易过长。8.在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少 DNA 团块形成。9. 提取的 DNA 不易溶解：不纯，含杂质较

3、多；加溶解液太少使浓度过大。沉淀物太干燥，也将使溶解变得很困难。10. 电泳检测时 DNA 成涂布状：操作不慎；污染核酸酶等 。11.分光光度分析 DNA 的 A280/A260 小于 1.8；不纯，含有蛋白质等杂质。在这种情况下，应加入 SDS 至终浓度为 0.5%，并重复步骤 2 8。12.酚 /氯仿/异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：含高浓度的 DNA，可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量DNA 电泳常见问题分析之一1 请问配制聚丙烯酰胺凝胶电泳胶时，促凝的是 TEMED 还是过硫酸铵？胶聚时间很长如何解决？过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所需的自由基，而 TEMED 通过

4、催化过硫酸铵形成自由基而加速它俩的聚合。胶聚合时间长可能是 TEMED 失效了，过硫酸铵固体时间过久也会失效的。一个让 PAGE 胶很快聚合的方法：不要先配 AP（过硫酸铵）溶液，因为 AP 很容易变质。在保证 TEMED 和 AP 质量的情况下，每次配胶时，直接称一定量的 AP 粉剂溶入液体状态的 PAGE 中，这样可以保证 AP 的催化能力，而且可以多加一点。配 25ml 的 PAGE 胶，加 0.03 克 AP 粉剂，最后加入 25ulTEMED，20 分钟左右就可以凝固（当然这个时候拔梳子，会有少量未凝固的 PAGE 在孔里形成丝状干扰，使加的样品看起来不太漂亮，但一般不影响跑胶效果和

5、条带的形状和位置）。 2 DNA 电泳的 MARKER 怎么是扭曲的？1、 配制胶时的缓冲液需要和电泳缓冲液不是同时配制的.最好是同时配制.电泳时缓冲液高过液面12mm 即可。2、 电泳时电压过高, 可以在电泳前 15 分钟用较低电压(3V/cm),等条带出孔后比较漂亮了.然后再调电压。3、 上样时尽量慢慢加样, 等样品自然沉降后再加电压。3 跑出的 DNA 带模糊？1、 DNA 降解：避免核酸酶污染。2、 电泳缓冲液陈旧:电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH 值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。3、 所用电泳条件不合适: 电泳时电压不应超过 20V/cm，温度

6、30 ；巨大 DNA 链电泳，温度应15 ；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。4、 DNA 上样量过多：减少凝胶中 DNA 上样量。5、 DNA 样含盐过高：电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。6、 有蛋白污染：电泳前酚抽提去除蛋白。7、 DNA 变性：电泳前勿加热，用 20mM NaCl 缓冲液稀释 DNA。4 有不规则 DNA 带迁移?1、 对于 /Hind III 片段 cos 位点复性：电泳前于 65加热 DNA 5 分钟，然后在冰上冷却 5 分钟。2、 电泳条件不合适：电泳电压不超过 20V/cm；温度30 ；经常更换电泳缓冲液。3、 DNA 变性：以 20mM NaCl Buff

7、er 稀释 DNA，电泳前勿加热。5 跑出的 DNA 条带带弱或无 DNA 带？1、 DNA 的上样量不够：增加 DNA 的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低。2、 DNA 降解：避免 DNA 的核酸酶污染。3、 DNA 走出凝胶：缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。4、 对于 EB 染色的 DNA，所用光源不合适 ?应用短波长（254nm ）的紫外光源。6 跑出的 DNA 带缺失不完整是怎么回事?1、 如果是小 DNA 带走出凝胶，可以缩短电泳时间或降低电压或增强凝胶浓度。2、 分子大小相近的 DNA 带不易分辨?增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度。3、 DN

8、A 变性：电泳前请勿高温加热 DNA 链，以 20mM NaCl Buffer 稀释 DNA。DNA 链巨大，常规凝胶电泳不合适?在脉冲凝胶电泳上分析。7 做 PCR 电泳后跑电泳，目的基因是 489BP 的，结果每次切胶回收后再跑电泳就变成 500 多了，快到 600 了？为什么？有时只靠电泳结果判断是不准确的，同样的片段每次跑的远近会有不同。有经验显示目的片段是1300 多，结果就跑到 1000 的 marker 下面去了，后来证实片段没有问题。也有做的一个片段也是这样，是 490BP.理论上两个条带一样，可是 PCR 结果显示就是大小不一致。然后回收以后的检测结果又全部都一样了，后来又拿

9、去做了下一个测序，才知道根本没有问题。8：为什么 marker 条带非常模糊，无法辨别具体条带？ A：出现上述情况，可能有以下几个原因：1. marker 条带出现了降解。请确保在使用过程中避免核酸酶污染；2. 电泳缓冲液陈旧。电泳缓冲液多次使用后，离子浓度降低，pH 值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果，建议经常更换电泳缓冲液；3. 电泳条件不合适。电泳时电压应不超过 20V/cm，温度应低于 30；4. marker 上样量过多。请根据说明书选用合适上样量；5. 凝胶质量不好。建议使用质量较好的琼脂糖；此外，凝胶凝固不均匀也会导致条带模糊。9：为什么 marker 条带出现不规则的条带（

10、如哑铃状等）？A：出现上述情况，多与以下几个原因有关：1. 电泳缓冲液陈旧。老化的电泳缓冲液离子浓度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果，建议经常更换电泳缓冲液；2. 电泳条件不合适。电泳时电压应不超过 20V/cm，电压太高可能也会导致 marker 条带出现不规则现象。此外，凝胶质量差以及凝胶冷却时凝固不均匀也会导致该现象出现。10 为什么 marker 条带非常弱或者根本没有条带？A：出现上述情况可能是：1. marker 上样量较低，可适当增加上样量；2. 凝胶质量较差或凝胶凝固不均匀也会导致电泳条带弱或根本没有条带；3. 电泳时间过长导致 marker 条带跑出凝胶，可缩

11、短电泳时间，降低电压，增加凝胶浓度。11：为什么 marker 缺带？A：对于含有较小片段的 marker，如果出现缺带现象，可能是因为：1. 小条带跑出凝胶或分子量大小非常相近的条带不易辨认所致，可适当缩短电泳时间，降低电压，同时增加凝胶浓度；2. 凝胶中 EB 含量过低，导致大片段结合 EB 量太少或没有，在紫外光下亮度太低，可适当增加 EB 用量。问题 原因 解决办法DNA 降解 避免核酸酶污染电泳缓冲液陈旧电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH 值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液所用电泳条件不合适电泳时电压不应超过 20V/cm，温度30；巨大 DNA 链

12、电泳，温度应15；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力DNA 上样量过多 减少凝胶中 DNA 上样量DNA 样含盐过高 电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐有蛋白污染 电泳前酚抽提去除蛋白DNA 带模糊DNA 变性 电泳前勿加热，用 20mM NaCl 缓冲液稀释 DNA对于 /Hind III 片段 cos 位点复性 电泳前于 65加热 DNA 5 分钟，然后在冰上冷却 5 分钟电泳条件不合适 电泳电压不超过 20V/cm；温度 30；经常更换电泳缓冲液不规则DNA 带迁移DNA 变性 以 20mM NaCl Buffer 稀释 DNA，电泳前勿加热DNA 的上样量不够 增加 DNA 的上样量；

13、聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低DNA 降解 避免 DNA 的核酸酶污染带弱或无 DNA 带DNA 走出凝胶 缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度对于 EB 染色的DNA，所用光源不合适 应用短波长（254nm ）的紫外光源小 DNA 带走出凝胶 缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度分子大小相近的DNA 带不易分辨 增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度DNA 变性 电泳前请勿高温加热 DNA 链，以 20mM NaCl Buffer 稀释DNA DNA 带缺失DNA 链巨大 常规凝胶电泳不合适 在脉冲凝胶电泳上分析问题 可能原因 解决方法核酸酶污染 每次吸取时更换灭菌枪头

14、，勿将电泳缓冲液带入管中；用后密闭 4C 保存DNA Marker降解保存不当 4C 或-20C 保存，避免多次反复冻融；不可加热琼脂糖质量差 使用质量可靠的琼脂糖制胶DNA Marker无法正确分离 电泳缓冲液多次使用后失效 更换缓冲液核酸浓度过低 增加上样量核酸降解 使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样品条带黯淡DNA 条带被示踪染料掩盖 提高上样量；避免使用与目的片段迁移率相同的示踪染料电泳缓冲液多次使用后失效 更换缓冲液核酸部分降解 使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样品核酸样品纯度差，含有 DNA结合蛋白或高浓度的盐份酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质电压过低，电泳时间过长 根据凝胶大

15、小和电泳缓冲液类型，使用适当的电压进行电泳条带模糊或弥散染色时间过长或拍照前放置过久，DNA 条带弥散电泳结束后及时观察、拍照DNA 条带分子量过大 使用脉冲凝胶电泳分子量接近的 DNA 条带没有分开选择适当的凝胶浓度进行电泳电泳缓冲液使用不当 SD 和 TBE 缓冲液适于分析较小分子量的 DNA 片段，大片段分子不能完全分离；TAE 缓冲液不适于分离很小的 DNA 片段条带缺失电泳时间过长或电压过高， 缩短电泳时间，调整电压DNA 走出凝胶电极插反，DNA 走出凝胶 正确连接电极方向核酸降解或形成聚合物 加热处理或重新制备样品 DNA 酶切 Marker 的 cos 位点复性电泳前 65C

16、加热 5 分钟，冰上冷却5 分钟以后再上样相同分子量的 DNA 片段由于结构或序列的差异而有不同的迁移率判断 DNA 分子是否有特殊结构，如缺口、超螺旋、二聚体等；富含 AT 碱基的DNA 迁移率比同分子量富含 GC 碱基的DNA 片段慢条带大小不正确梳子变形，点样孔不在同一水平线上使用完好的梳子制胶不同样本的上样条件不同 选用相同的上样缓冲液，上样量尽可能接近上样量过大或过小 选择合适大小的上样孔，样品应完全覆盖点样孔底部核酸样品纯度差，含有 DNA结合蛋白或高浓度的盐份酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质电泳缓冲液未完全浸没凝胶 上样和电泳时，确保缓冲液始终能完全覆盖凝胶电压过高或电泳时间过长致使凝胶过热和 DNA 变性根据凝胶大小和电泳缓冲液类型，使用适当的电压进行电泳凝胶中加入 EB 造成染色不均 加入 EB 时充分混匀或电泳结束后再染色凝胶中有气泡或污染物 使用纯水和洁净容器制胶；缓慢灌胶，并赶除气泡带型异常点样孔质量差 待凝胶完全凝聚后再取出梳子；