Rhodobacter sphaeroides的phrA基因编码的光聚酶以及单线态氧和过氧化物以σ-依赖的方式对光聚酶的调节作用.doc

1、Microbiology (2007), 153, 18421851DOI 10.1099/mic.0.2006/004390-0浑球红细菌的 phrA 基因编码的光聚酶以及单线态氧和过氧化物以 E-依赖的方式对光聚酶的调节作用摘要：浑球红细菌是一种兼性光合作用菌，它的基因组能够编码 3 种光聚酶/隐花色素家族蛋白质。本文显示了 phrA (RSP2143)编码的一种功能性光聚酶，这种光聚酶是一种能够修复 UV 辐射诱导的 DNA 损伤的，修复的过程具有蓝光依赖性特征。在光存在的条件下，phrA 生物表达具有正向调节效应，该调节过程不包括光感受器或者光合电子转移。这个结果显示单线态氧和过氧化物

2、依赖的信号是通过 E-因子来传递的，并且通过抗 E-因子来影响 phrA 的表，而超氧负离子不会 phrA 的的表达。因此， E 调节子不仅仅参与对单线态氧反应，也参与到对过氧化物的反应中。引言所有的有机体都暴露于太阳光下，来面对 UV 诱导的 DNA 损伤的问题。主要的光产物是环丁烷嘧啶二聚体（CPDs） ，含量比较低的是嘧啶-嘧啶（6-4）光产物(reviewed by Sancar, 2003)。这两种光产物的积累会导致 DNA 的复制和转录过程被阻断，而这将会使细胞致死。在蓝光或者近 UV 区 ，DNA 光聚酶修复这些光产物的光化反应，就比如光复活作用(Rupert 等., 1958)

3、。光聚酶与隐花色素的相关性非常大，它们都属于相同的蛋白质家族的成员(Cashmore 等., 1999)。隐花色素缺乏光复活作用的能力，但是我们了解到的它的抑制的一些功能，例如：在不同的有机体中的蓝光光受体会受到 COP1 和时钟蛋白类的相互影响(Yang 等., 2001; Lin Sancar, 2003)。光照条件会使植物的隐花色素间接影响茎的延伸以及光周期性的开花(reviewed by Lin 图 1)。目前已经鉴定出的隐花色素有果蝇属的隐花色素、鼠耳芥隐花色素、集胞藻属隐花色素、人类(隐花色素 DASH)的蛋白质缺乏 C-末端的延伸。我们发现这个隐花色素的群体能够特异性的修复单联

4、DNA 的 CPDs(Selby Ueda et al., 2005; Fujihashi et al., 2007)，作为一种捕光色素（ photontenna） 。浑球藻属的不产氧光合变形菌的代谢作用极其多样化。浑球红细菌利用光进行不产氧光合作用，并且也可以进行有氧呼吸和无氧呼吸。对于自由生活的水生细菌，在它的天然的栖息地中，浑球红细菌暴露在太阳光(Page 等., 2004)。然而，高强度的太阳辐射是有害的，是因为会产生 DNA 的光产物。存在氧和红菌叶绿素时，浑球红细菌会产生高活性的单线态氧，这将会导致光化学损伤的产生(Borland 等., 1987)。为了使光化学损伤的风险最小，依

5、据环境条件的变化，红细菌具有变化的复杂的调节回路，它可以控制光合基因的表达。在高氧张力条件下，无论是有氧还是无氧环境，细菌事实上几乎是未染色的，并且进行有氧呼吸。只有当氧分压下降时，光和器官会形成(Zeilstra-Ryalls 等., 1998)。当浑球红细菌生长于缺氧条件下进行无氧呼吸，光照对光和基因的表达具有刺激效应(Braatsch 等., 2002)。目前对于保护浑球红细菌来抵抗光化学损伤的压力的调查研究发现，需要 E-因子(RSP1092) 以及抗 E-因子 ChrR(RSP1093)的参与(Anthony 等., 2005; Glaeser top line)和集胞藻 sp. P

6、CC 6803(Brudler 等., 2003; bottom line)的晶体结构中获得结合有辅因子 FAD (F) 和 8-HDF (H)的氨基酸。括号内显示了蛋白质的长度。Sco. Phr,是聚球藻 sp. 6301的光聚酶(Tamada 等., 1997)；R.s. PhrA,是浑球红细菌的光聚酶；R.s. 1981,是浑球红细菌 RSP1981 基因的光产物；R.s. 3077,是浑球红细菌 RSP3077 基因的光产物；Scy. Cry,是集胞藻 sp.PCC6803 的隐花色素DASH(Brudler 等., 2003)。用 MultAlin 软件进行对比(http:/prod

7、es.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html)。浑球红细菌的基因组能够编码 3 种蛋白，RSP1981, RSP2143 和 RSP3077 产物，与光聚酶和隐花色素非常相似。在此，我们显示了 RSP2143，我们推断它为phrA(Braatsch 等., 2004)，编码一种功能性的光聚酶。 RSP3077 也充当着光聚酶的功能，而 RSP1981 对光复活反应没有功能。此外，在不同的生长条件下，phrA 的表达的的分析显示光复活作用会受到 E/ ChrR 系统的调节。方法菌株和生长条件本研究中使用的所有菌株都在表 1 中列出来了。大肠杆菌（Esche

8、richia coli）的菌株用 LuriaBertani（LB）培养基培养，温度为 37，转速为 180 r.p.m 连续振荡培养。浑球红细菌的培养条件为：盐度最小的苹果酸培养基(Drews, 1983)，温度为 32，140 r.p.m 连续的振荡培养。在整个实验过程中，对于半需氧的浑球红细菌的生长，培养瓶中氧气的浓度是 10424 mM。用 Pt/Ag electrode (microoxygen sensor 501, UMS, Meiningen, Germany)来监测氧分压，氧分压的调节通过改变振荡培养的速度。在进行光照之前，将过夜生长的细胞置于这些不同的转速的条件下生长双倍的时

9、间，并且当培养物的 OD660 值达到 0.2 时开始进行实验。半需氧生长通过从 500W 的卤素灯中获得蓝光或者从高压水银等中获得蓝光(Schoeffel Instruments Co.)，卤素灯和高压水银的光需要先通过具有热吸收能力的过滤器 KG1 和过滤器 BG12 联合器(Schott)。这种过滤器的最大透光的波长是 400nm，它的半环的宽度80nm，并且在317nm 或者515nm 处没有可探测的光传递。在培养水平上对每一种光量的光子通量密度的检测分别是 10 mol 光子 m -2 s -1 (3 W m -2 )或者是至少 60 mmol 光子 m -2 s -1 (60 W

10、m -2 )。表 1 本研究中使用的菌株和质粒*Kmr , 卡那霉素抗性; Smr , 链霉素抗性; Spr , 大观霉素抗性; Tcr , 四环素抗性; Tpr , 三甲氧苄二氨嘧啶抗性.对于有氧生长，当过夜培养的培养液的 OD660 达到 0.2 时，将培养物转接到培养瓶中，并且通入空气，使培养瓶中的氧气浓度大约能达到 180 mM。为了检测光照对生长的影响，在黑暗条件下生长的培养物，当 OD660 达到 0.4 时，用 500W 的卤素灯照射培养物，光照的强度为 800 W m -2 (750 mol 光子 m-2 s-1 ;高强度的白光)，或者 800 W m -2 (380mol 光

11、子 m-2 s-1 ;高强度的红光)，或者30 W m -2 (18 mol 光子 m-2 s-1 ;低强度的白光)。过滤器的发射波长大于600nm，被用于红光照射。用 LI-250 光公尺来检测 W m -2 的光能，LI-250 光公尺带有 LI-200SA 辐射传感器(光谱响应的波段为 4001100 nm, LI-Cor)；并且用LI-189 光公尺来检测 mol 光子 m-2 s-1 的光子通量，LI-189 光公尺带有一个 LI-190SA 的量传感器(光谱响应的波段为 400700 nm, LI-Cor)。根据实验的需要，抗生素使用的浓度如下，卡那霉素：25g ml-1；四环素：

12、20g ml-1（E. coli）或者 2g ml-1（R. sphaeroides） ；三甲氧苄二氨嘧啶：50g ml-1（R. sphaeroides） 。在有光条件下，不添加四环素。为了产生单线态氧，向培养基中加入甲基蓝(Sigma-Aldrich)，终浓度为：0.2 mM。为了检测过氧化氢（H 2O2）以及超氧负离子对 phrA 表达的影响，当 OD660 达到 0.5 时，向浑球红细菌的培养基中加入 H2O2 和百草枯（除草剂） ，使其终浓度为 1 mM。光复活作用的活力当红细菌的过夜培养物生长到 OD 660 达到 0.8 时，用盐度最小的苹果酸培养基按 1 : 100 的比例进行

13、稀释。在 254nm 下经过不同剂量的 UV 光照射(UVcross-linker 1800, Stratagene)，将细胞涂布在琼脂平板上，置于暗室中培养（有微弱的红光） ，之后再将其置于 58 W 的荧光灯 (TLD 58W/25, Philips)下培养。进行光复活反应，用塑料培养皿覆盖在平板上。培养基水平上检测光子通量密度是 3540 mol 光子 m-2 s-1(LI-190SA quantum Sensor, LI-Cor; spectral response 400700 nm)。对照组的平板用铝箔包好，置于黑暗环境下进行生长培养。经过3 天的培养之后，进行菌落计数，并且计算了

14、与未经 UV 照射的对照组相比的存活率。遗传技术根据标准的实验方法(Sambrook 用于 RSP1981 基因扩增的寡核苷酸片段：1981HindIIIup (59-GGGAAGCTTCGCGACCTGCCTCG-39), 1981ScaIup (59-CCGGCCCAGTACTGCAGG-39), 1981ScaIdown (59-GTGGATGCAGTACTGCGCG-39)和1981XbaIdown (59-CGTCTAGAAACATGACCAATCCGCC-39) ；以及用于 RSP3077 基因扩增的寡核苷酸片段：3077HindIIIup (59-CCCAAGCTTGGGCTCG

15、ACTGGAGCCGA-39), 3077ScaIup (59-AAAAGTACTTTTCGATCAGCCGCCAGTC-39), 3077ScaIdown (59-AAAAGTACTTTTCGCGCTGCTGGCGGG-39)和3077XbaIdown (59-GCTCTAGAGCTTCCGCCTCGGTCAGA-39) 。Kmr 基因(Vieira 图. 1)。光聚酶有 3 个保守的色氨酸残基，这很可能是参与还原 FADH 2 的电子转移(Byrdin 等., 2003, Fig. 1)。这些保守的残基会出现在 PhrA 中，但是很明显在 RSP1981 和 RSP3077 中缺乏。然而，

16、因为通过点突变锁住了色氨酸链上的光还原作用，因为点突变对 E. coli 体内的光聚酶的活力几乎没有生理学意义(Kavakli Daiyasu等., 2004)可以修复单链 DNA 的成员。虽然，RSP3077 只表现出与该家族的成员仅仅有很低的序列同一性(达到 9 %)，在序列同一性这一方面我们排除RSP3077 的功能，并且我们推断 RSP3077 的作用的扮演着第二种终光聚酶的功能的角色。phrA 的表达受到 E 和抗 E-因子的调节到目前为止，目前还没有证据可以证明，在该领域中我们研究任何有机体，有特异性性的调节机制调节光聚酶基因。先前对 phrA 基因启动子区的研究显示，我们推断存在

17、一个 EDNA 结合位点，该结合位点的序列与 rpoE 的共有序列相同(Braatsch 等 ., 2004)。另外的转录子分析以及体外转录的研究支持了一个观点，phrA 基因受到 E 的控制 (Anthony et al., 2005)。为了证实这些数据，并且检测抗- E 因子 ChrR 的参与的过程，我们对比了在黑暗以及氧分压高的情况下生长的不同菌株的 phrA 的表达水平，这些菌株是：野生型的浑球红细菌 2.4.1；衍生的变异菌株 TF18；ChrR 菌株。突变菌株TF18 含有 rpoE，并且它的 chrR 基因倍敲除了(Schilke Mitani Yasuhira 等., 1991

18、) 中，蓝光以及 H2O2 可以诱导光聚酶基因的转录。Kihara 等. (2004)指出了，近 UV 光(300 400 nm)和太阳光可以提高真菌蠕霉中光聚酶基因的表达。因此，很有可能在一般的应激下，phrA 基因的表达会出现正调节。为了验证这个假说，我们用 phrA : lacZ 报告质粒进行实时 RT-PCR 来观察，不同光照条件下培养的菌株的 E/ChrR 依赖的 phrA 的表达。我们用亚甲基蓝作为光敏剂使培养的菌株（经过 UV 辐射）产生单线态氧，并且检测 phrA时候对其他的活性氧簇产生作用，比如：H 2O2 或者超氧负离子，检测的方法E/ChrR 依赖的 phrA 的表达。带有报告质粒 pPHUphrAlacZ 的浑球红细菌 2.4.1 以及突变体菌株 TF18 和ChrR 菌株先生长在黑暗以及氧分压也很高的条件下；然后转移到高强度的白光