Megazyme 总淀粉测定试剂盒翻译.doc

1、Megazyme 总淀粉测定试剂盒（K-TSTA 04/2009）简介:酸水解法和酶法被广泛的应用于淀粉含量测定,酸水解法仅仅适用于纯净的淀粉样品,应用范围有限。酶法的前处理步骤上有各种变化，经过凝胶、液化和糊精化作用,糊精水解生成葡萄糖,最终以测量的葡萄糖计算淀粉含量。AACC方法76-11特殊之处在于：在高压蒸汽和碱性环境下淀粉糊化成为凝胶，然后再用淀粉葡糖苷酶将淀粉转化为葡萄糖进行测量。AACC方法76-11会低估某些样品的淀粉含量，包括高多糖玉米淀粉和众多的经过加工的谷物产品。今天应用的众多的测定方法都使用了联合处理方法,如在样品处理过程中或直接在淀粉凝胶化后使用耐热-淀粉酶。对于难凝

2、胶的样品 (如高多糖玉米淀粉 )使用了氢氧化钠或二甲基亚砜作为溶剂。为确保膳食纤维中的淀粉能够全部溶解，Englyst 和Cummings(1988)总结的处理方法中使用了去分支酶,支链淀粉酶。为了测量极端样品得到满意结果，兼顾数量和可靠性，Megazyme 提供了一个总淀粉分析试剂盒，基于使用耐热性淀粉酶和淀粉葡糖苷酶。这一方法已被 AOAC 和 AACC 采用 (Method 76.13)。最近，耐热淀粉酶可在低pH 环境下使用。因此，我们更新了我们的总淀粉测量方法加入了这种酶。这一改进的最大益处在于可以在同一pH （pH5.0）条件下进行耐热性淀粉酶和淀粉葡糖苷酶孵育，简化步骤以及减少麦

3、芽酮糖（抗耐热性淀粉酶和淀粉葡糖苷酶水解）的产生。另一改进是使用己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脱氢酶/ NADP+在D- 葡萄糖处理步骤(K-TSHK5)。Megazyme总淀粉分析方法可以测量广泛范围内食品，饲料，植物和谷类产品（自然的或加工的）。对于大多数样品（例如小麦面粉），淀粉可以在100C抗耐热性淀粉酶处理步骤中完全可溶。包含高水平抗性淀粉（例如高多糖含量玉米淀粉）样品，需要先用冷2 M KOH 或 热DMSO进行预溶解。含可溶性淀粉和糊精的样品，无需进行 抗耐热性淀粉酶处理。原理:抗耐热性淀粉酶水解淀粉为可溶性分支麦芽糊精和去分支麦芽糊精。样品中的抗性淀粉可用 2M KOH 进行预溶解

4、，再用醋酸钠缓冲液进行中和再进行淀粉酶水解。或者用 DMSO 在 100C 进行溶解。淀粉葡萄糖苷酶水解麦芽糊精至 D-葡萄糖。D-葡萄糖氧化为D- 葡萄糖酸脂，释放出(H2O2) ，再用过氧化氢酶催化进行显色反应，产生醌亚胺染料。样品包含高水平的 D-葡萄糖和麦芽糊精可以在分析前用 80%乙醇进行洗涤。单个样品可在 70分钟内完成测定。20 个样品可在 2 小时内完成。特异性，灵敏度，线性范围和精确性此试剂盒专用于分析-葡聚糖（包括淀粉，糖原，植物糖原和非抗性麦芽糊精）。最小可区分的吸收值是0.01吸收值范围。这对应于1.0mg的 D-葡萄糖（或0.9mg淀粉）/L在最大样品体积1ml。检测

5、极限： 2.0mgD-葡萄糖（或1.8mg 淀粉）/L，这对应于0.02 吸光度区别在最大体积1ml中。此试剂盒在5-100ugD-葡萄糖范围内呈线性。一个样品溶液的重复测定中，吸收值会有0.005至 0.010的波动。当样品体积为1ml 时，这相当于0.05-1ml/L 浓度的D-葡萄糖。如果样品在准备过程中被稀释，结果需要乘以稀释倍数。例如在样品准备时，样品称重，如10g/L，变异范围将在0.02 至0.05g/100g。干扰:如果D-葡萄糖的转化在5分钟内完成，不会产生干扰。可以通过加入D- 葡萄糖至反应完成后试管内（例如50ug在0.1ml ）以检测干扰。可以看到吸光度显著上升。样品内

6、的干扰物质可以通过加入内标进行分析。可以对这标准进行定量校正。样品操作中的损失可以通过在起始步骤中加入D-葡萄糖进行校正。试剂盒成分Megazyme 总淀粉含量测定试剂盒提供有足够运行 100 次试验的试剂 ,并提供有全部的试验方法:瓶 1: 耐热 -淀粉酶(10mL, 3,000U/mL 在 CERALPHA 试剂中 pH6.5; 40C 或 1600U/mL在 CERALPHA 试剂中 pH5.0; 40C)。稳定性4 年, 4C 保存。瓶 2: 淀粉葡糖苷酶(10mL, 3300U/mL 在可溶性淀粉)（或 200U/mL 在 p-nitrophenyl-maltoside*，pH4.5

7、 ，40C ）稳定性4 年, 4C 保存。完整的分析程序可在 获得。瓶 3: GOPOD 试剂缓冲液。磷酸钾缓冲液（0.26M，pH7.4） ，对羟基苯甲酸（0.22M） ，叠氮化钠（0.4%W/V）稳定性4 年, 4C 保存。注意：1. 如果GOPOD 缓冲液存储在 -20C，会形成盐结晶，用双蒸水稀释至1L前必须完成溶解。2. 此溶液含叠氮化钠（0.4%W/V） ，有毒。 瓶 4: GOPOD 试剂酶。葡萄糖氧化酶( 12,000 U) 和过氧化物酶 ( 650 U)和 4-氨基安替比林（80mg）。冻干粉，稳定性4 年, -20 C 保存。瓶 5: 葡萄糖标准溶液（5ml，1mg/mL

8、）在 0.2% W/V 苯甲酸溶液中。稳定性4 年，室温保存。 瓶 6: 标准的玉米淀粉。淀粉含量见标签。稳定性 4 年, -20C 保存。准备试剂溶液溶液 1 用试剂 1（100mM 醋酸钠缓冲液 , pH5.0，自备）稀释 1.0mL 瓶 1 成分至 30mL 。分成小份后冻存。稳定性3 年, -20C 保存。注意：如果按照 AOAC 方法 996.11（example b） ，用试剂 4（50mM MOPS 缓冲液,pH7.0 ）稀释酶。溶液 2 此酶不用稀释可以直接使用,由于酶溶液具有一定粘稠度,所以必须使用正确的移液器。4C 下保存,稳定性3 年。溶液 3 用蒸馏水稀释瓶 3 成分（

9、GOPOD 试剂缓冲液）到 1L, 立即使用。溶液 4 用 20ml 溶液 3 溶解瓶 4 成分再倒回溶液 3 瓶子。铝箔纸包裹避光。这就是 葡萄糖测定试剂(GOPOD 试剂 ) 稳定性: 4C 下保存，3 个月；-20 C 下保存， 12 个月； 分装成小份再进行冻存，只能冻融一次。新鲜配制的试剂呈浅黄色或浅紫色。4C 下保存 2-3 个月过程中，逐渐变成深紫色。用水为空白对照时，此溶液的吸光度6 个月。注意：可通过添加叠氮化钠（0.2g/L）增加此缓冲液的稳定性。室温 2 年。必须在 pH 调完后再加入叠氮化钠。酸化的叠氮化钠会释放出有毒气体。2.醋酸钠缓冲液(1.2M, pH3.8) 6

10、9.6ml 冰醋酸(1.05g/mL)加入 800mL 蒸馏水, 用 4M NaOH 调节 pH 到 3.8, 定容到1L。室温下保存 12 个月。3.氢氧化钾溶液（2M）加入112.2 g KOH 至900 mL 去离子水，搅拌溶解，定容一升。储存于密闭容器。室温下2年。4. MOPS 缓冲液(50mM,pH7.0)+氯化钙(5mM) +叠氮化钠(0.02%)（仅用于 example b 分析样品）11.55g MOPS(钠盐, Sigma cat. M-9381)加入 900mL 蒸馏水, 用 1M(10%V/V)HCl 调节pH 到 7.0,大约需要 17mL。 添加二水氯化钙(0.74

11、g)和叠氮化钠 (0.2g), 完全溶解, 然后调整到 1L, 4C 下保存 6 个月。5. 醋酸钠缓冲液(200mM,pH4.5)+叠氮化钠(0.02%)（仅用于 example b 分析样品）冰醋酸(11.8mL,1.05g/mL)加入 900mL 蒸馏水, 用 1M(4g/100mL)NaOH 调节 pH 到 4.5,大约需要 60mL。加入叠氮化钠(0.2g), 完全溶解,然后调整到 1L, 4C 下保存 6 个月。注意：可通过添加叠氮化钠（0.2g/L）增加此缓冲液的稳定性。室温 2 年。必须在 pH 调完后再加入叠氮化钠。酸化的叠氮化钠会释放出有毒气体。设备:1.玻璃试管(圆底;1

12、6x120mm 或 18x150mm)2.离心机(3,000rpm)3.微量移液器(100uL).4.连续分配器5.分析天平.6.分光光度计 510nm.7.漩涡混合器8.定时钟9.沸水浴锅和试管夹注意事项:1.GOPOD 试剂的孵育时间没有严格规定,但是至少要 20 分钟 ,并在 60 分钟内测定吸光度.2.每次试验必须设定试剂空白对照和葡萄糖对照(100g, 四倍) 。a)试剂空白对照: 0.1mL 蒸馏水+3.0mLGOPOD 溶液b)葡萄糖对照包括:0.1mL 葡萄糖标准溶液(100 g/0.1mL)+3.0mLGOPOD 溶液。因子F（页码 13 和 14）通过 D-葡萄糖在标准分析

13、中读得的吸光度进行计算（例如100/1.038=96.386） 。3.每次试验必须设定标准面粉或淀粉样品4.每一新批此的 GOPOD 溶液 ,必须验证其与 100g 葡萄糖标准反应产生颜色所需要的最长时间, 通常为 15 分钟左右。样品空白:样品空白按照标准试验程序（example A）进行,将第 4 步修正为添加 3mL 蒸馏水,第5 步中也用蒸馏水替代其中的淀粉葡糖苷酶.也可以用样品前处理中所用的酒精作为样品空白( example E)。样品准备示例A.不含抗性淀粉，D-葡萄糖和麦芽糊精的谷物和食物（建议的程序，pH5.0 孵育） 。1.研磨谷物, 过 0.5mm 筛（35 目） 。2.将

14、研磨后样品(准确称量100mg)加入到试管中(16x120mm),确保全部样品位于试管底部。3.加入 0.2mL 乙醇溶液(80%v/v)湿润样品帮助分散, 用漩涡混合器混合。4.立即加入 3mL 耐热 -淀粉酶(100mM 醋酸钠稀释), 在沸水浴中孵育 6 分钟( 在孵育 2 分钟,4 分钟，6 分钟的时强烈振荡试管).注意:在这一步中强力震荡是关键，目的是确保浆状样品能完全的混匀（去除块状） 。同样,每间隔 2 分钟振荡也是为了防止由于酒精蒸发导致某些样品被喷出试管。如果使用聚丙烯管，增加孵育时间至 12 分钟，在 4, 8 和 12 强烈震荡。 5.将试管放置于 50C 的水浴锅中 ,

15、 加入 0.1mL 瓶 2 成分（淀粉葡糖苷酶 ,330U 在淀粉上） 。充分混合,在 50C 下孵育 30 分钟。6.将全部的溶液转移到 100mL 的容量瓶中,用洗瓶冲洗试管,并也倒入容量瓶中,然后用蒸馏水调整溶液体积, 充分混匀。取部分溶液离心(3,000rpm,10 分钟) 。取清澈的未稀释的上清用于分析。注意：对于含有 1-10%淀粉的样品,在第 6 步中用蒸馏水调整溶液至 10mL,充分混匀,离心(3,000rpm,10 分钟), 该溶液可以直接进行第 7 步.对于含 10-100%淀粉的样品,用蒸馏水稀释 1.0mL 样品液到 10mL 再进行第 7 步。7.转移两份稀释的样品溶

16、液(0.1mL)到园底试管中(16x100mm)。8.加入 3.0mLGOPOD 溶液到每一个试管中(包括葡萄糖对照和试剂空白对照), 然后在 50C 下孵育 20 分钟9.葡萄糖对照包括 0.1mL 葡萄糖标准溶液(1mg/mL)+3.0mLGOPOD 溶液。 试剂空白对照: 0.1mL 蒸馏水+3.0mLGOPOD 溶液10.相对于试剂空白在 510nm 下测定每一个样品和葡萄糖质控的吸光度。B.不含抗性淀粉，D-葡萄糖和麦芽糊精的谷物和食物（AOAC 996.11） 。1.研磨谷物, 过 0.5mm 筛（35 目） 。2.将研磨后样品(准确称量100mg)加入到试管中(16x120mm)

17、,确保全部样品位于试管底部。3.加入 0.2mL 乙醇溶液(80%v/v),用漩涡混合器混合。4.立即加入 3mL 耐热 -淀粉酶(50mM MOPS 稀释), 在沸水浴中孵育 6 分钟(在孵育 2 分钟,4分钟，6 分钟的时强烈振荡试管).注意:在这一步中强力震荡是关键，目的是确保浆状样品能完全的混匀（去除块状） 。同样,每间隔 2 分钟振荡也是为了防止由于酒精蒸发导致某些样品被喷出试管。如果使用聚丙烯管，增加孵育时间至 12 分钟，在 4, 8 和 12 强烈震荡。 5.将试管放置于 50C 的水浴锅中 , 加入醋酸钠缓冲液（4ml，200mM ，pH4.5 ） ，加入0.1mL 瓶 2

18、成分（淀粉葡糖苷酶, 20U） 。充分混合,在 50C 下孵育 30 分钟。6. 按照 example A 步骤 6 继续实验。C.含抗性淀粉，不含 D-葡萄糖和麦芽糊精的谷物和食物（建议 KOH 溶解）1.研磨谷物, 过 0.5mm 筛（35 目） 。2.将研磨后样品(准确称量100mg)加入到试管中(16x120mm),确保全部样品位于试管底部。3.加入 0.2mL 乙醇溶液(80%v/v),用漩涡混合器混合。4.放入搅拌架子，加入 2ml 2M KOH 至每个试管中，冰水混合浴中搅拌 20 分钟左右，重悬粉末和溶解抗性淀粉。注意：1.不要使用涡旋仪混匀，会使淀粉乳化。2.确保加入 KOH

19、 时，试管处于剧烈震荡状态。这是为了避免淀粉形成团块难以溶解。5.当试管在磁力搅拌器上搅拌时，加入 8ml 1.2M 醋酸钠缓冲液（ pH3.8）至每个试管。立即加入 0.1ml 耐热 -淀粉酶（瓶 1）和 0.1mL 淀粉葡糖苷酶（瓶 2） ，充分混合,在 50C下孵育6. 孵育 30 分钟，间断混匀。7. 样品淀粉含量10%：将全部的溶液转移到 100mL 的容量瓶中,用洗瓶冲洗试管,并也倒入容量瓶中,然后用蒸馏水调整溶液体积至 100ml, 充分混匀。取部分溶液离心 (1800g,10 分钟)。8. 样品淀粉含量10%：直接离心(1800g,10 分钟) 。总体积约 10.4ml（此体积

20、可能有一定波动，特别是湿样品用于分析时，估计体积用于计算） 。9. 按照 example A 步骤 7 继续实验。D.含抗性淀粉，不含 D-葡萄糖和麦芽糊精的谷物和食物（AOAC 996.11 DMSO 溶解）1.研磨谷物, 过 0.5mm 筛（35 目） 。2.将研磨后样品(准确称量100mg)加入到试管中(16x120mm),确保全部样品位于试管底部。3.加入 0.2mL 乙醇溶液(80%v/v),用漩涡混合器混合。4.立即加入 2ml DMSO，涡旋混匀。沸水浴 5 分钟。5.按照 example A 步骤 4 继续实验。E.含 D-葡萄糖和麦芽糊精的谷物和食物1.研磨谷物, 过 0.5

21、mm 筛（35 目） 。2.将研磨后样品(准确称量100mg)加入到试管中(16x120mm),确保全部样品位于试管底部。3.加入 5mL 乙醇溶液(80%v/v)，80-85C 孵育 5 分钟。涡旋混匀，再加入 5ml 乙醇溶液(80%v/v)。4.离心 1800g（3000rpm）10 分钟。去除上清。5.10mL 乙醇溶液(80%v/v) 重悬沉淀。离心去除上清。6. 按照 example A 步骤 4 继续实验。若样品含抗性淀粉，按照 example C 步骤 4 继续实验。计算: A=相对于试剂空白所读取的吸光度FV=总体积（例如 100ml 或 10ml）0.1 =样品分析体积1/1000=转化从 ug 至 mg100/w=淀粉作为干粉重量的比例。W=干粉重量162/180=D 葡萄糖转化为脱氢葡萄糖淀粉%(占干物质比重):淀粉%X100/100-水分含量(%)