RNA的变性电泳原理.doc

1、RNA 的琼脂糖凝胶电泳实验原理 RNA 电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用 1.0%-1.4%的凝胶，不同的 RNA 条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下， RNA 的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定 RNA 分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总 RNA 样品完整性时，配制普通的 1%琼脂糖凝胶即可。 基本过程同 DNA 电泳一样，但应明确一点的是，因为 RNA 分子对 RNA 酶的作用非常敏感，因此必须用对 RNA 酶有抑制作用 DEPC 水来配置所有溶液，所有与 RNA 接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少 RNA 酶对样品的

2、降解；另外，因为 RNA 分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。RNA 非变性琼脂糖凝胶检测实验材料、器具及药品 蘑菇的总 RNA 溶液。 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。 琼脂糖，1XTAE 电泳缓冲液，0.5 g/ml 溴化乙锭（EB）10X 载样缓冲液。 实验步骤 （1 ）用 1TAE 电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加 1TAE 电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。（2 ）在超净工作台上，用移液器吸取总 RNA 样品 4 ul 于封口膜上。在实验台上再加入 5 ul 1TAE 电泳缓冲液及 1 ul 的 10

3、X 载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。（3 ）打开电源开关，调节电压至 100V，使 RNA 由负极向正极电泳，约 30min 后将凝胶放入 EB 染液中染色 5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察 RNA 电泳结果。非变性电泳：上样量超过 3ug，电压超过 6V/cm，电泳缓冲液时间太长，均可能导致 28S 和 18S 条带分不开。使用 2ug 上样量，电压小于 6V/cm，使用新鲜的电泳缓冲液并且频繁混匀两极的缓冲液，是获得好的电泳结果的前提。(以 DNA 标准为参照，28S 和 18S 分别位于 2.0kb 和 0.9kb 左右。) 变性电泳条带变淡：EB 与单链的结合能力要

4、差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些。另外的可能是甲醛的质量不高。RNA 的变性琼脂糖凝胶检测试剂： （1 ） MOPS 缓冲液（10*）:0.4mol/L 吗啉代丙烷磺酸（ MOPS）(PH7.0)，0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA。 （2 ）上样染料：50%甘油， 1mmol/L EDTA ,0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝。 （3 ）甲醛。（4 ）去离子甲酰胺。电泳槽清洗：去污剂洗干净（一般浸泡过夜）水冲洗乙醇干燥3%H2O2灌满室温放置 10 分钟0.1%DEPC 水冲洗。操作： （1 ） 将制胶用具用 70%乙醇冲冼一遍，晾干备用。 （2 ） 配

5、制琼脂糖凝胶。 称取 0.5g 琼脂糖，置干净的 100ml 锥形瓶中，加入 40ml 蒸馏水，微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。 待胶凉至 60-70 ，依次向其中加入 9ml 甲醛、5ml 10X MOPS 缓冲液和 0.5 ul 溴化乙锭，混合均匀。 灌制琼脂糖凝胶。 （3 ） 样品准备： 取 DEPC 处理过的 500 ul 小离心管，依次加入如下试剂： 10x MOPS 缓冲液 2ul，甲醛 3.5 ul,甲酰胺（去离子）10 ul，RNA 样品 4.5 ul,混匀。 将离心管置于 60水浴中保 10 分钟，再置冰上 2 分钟。 向管中加入 3 ul 上样染料，混匀。（4 ）上样。

6、（5 ）电泳：电泳槽内加入 1XMOPS 缓冲液，于 7.5V/ml 的电压下电泳。 （6 ）电泳结束后，在紫外灯下检查结果。RNA 提取、电泳注意事项，有几点说得很好啊快速的操作，低温环境，少量取上清主要是抽提之后吸取上清时要特别小心，只要不把蛋白层吸出来就不会有 RNase 污染。分子克隆第二版 343 页,上关于提取 RNA 所用的玻璃容器的处理方法,是用前 180 度干烤 8小时或更长时间;另一种方法是 0.1%的 depc 水浸泡(37 度 2 小时),然后灭菌水淋洗数次,100度干烤 15 分钟,然后高压灭菌除去 depc.我们实验室一直是用 170 度考 4 小时, 且不准离人,

7、不准过夜,可能是怕 烤箱长时间高温, 线路老化会发生危险吧 提取 RNA 所用的枪头，EP 管。直接高压烘干即可。如果用 0.1DEPC 处理，要在 DEPC 配置后振摇 1 小时后再浸泡枪头， EP 管方有效。我做的都是将枪头泡在配制好的 depc 中，摇振过夜，然后倒掉 depc 注意要到干净，再高压，为了防止仍残留液体可 120 度干烤一会A.对于提取 RNA 来说,我认为关键的一点在于实验器材的准备.包括从最初的标本的制备,保存,以及之后的试剂的准备, 匀浆器 ,镊子,tip 头的去除 RNase 处理,尤其是去除 RNase 的 DEPC处理步骤B. 您在处死大鼠前,先准备好干净的冻

8、存管 (用 1.5ml 的 Ep 管也可以,就是后面您在从液氮中取出的时候容易爆,您的注意安全),然后将去除的骨骼肌立即用 干净的剪刀分成半颗到一颗黄豆大小,装入冻存管后立即投入液氮保存.个人认为在这里使用装标本的管子没必要用DEPC 处理C.在提取 RNA 之前, 将试剂(TRIzol)和器械(tip 头,镊子, 匀浆器)都准备好D.从液氮取出标本后,立即转移进入事先加入 TRIzol 的匀浆器内(最好置冰上操作), 立即匀浆,一直到标本完全碾磨碎,这个时候 TRIzol 液体成浑浊状, 而且匀浆器的壁上没有太多的黏附组织,然后将 TRIzol 转出, 继续后续的步骤.1 RNase 是一种

9、蛋白酶，能够降解 RNA。2 我们的手上皮肤上有很多，应该是对我们的身体起保护作用。保护不被 RNA 病毒感染？或者什么的。3 这个酶高效稳定。要么在 DEPC 水中处理 n 小时，要么在 160 度高温烘烤 6 小时。此酶才会失效。4 所谓 DEPC，是一种叫做焦碳酸二乙酯的东西。有毒啊。所谓 DEPC 水，一般指两种状态，a，配制好未消毒；b，配制好已消毒。通过高压消毒，该物质会降解，从而无毒。1 无菌蒸馏水中加入 0.1%(v/v)焦碳酸二乙酯（DEPC） ，室温搅拌 4 小时以上至完全溶解，高压灭菌 20 分钟，冷却备用。这个是 DEPC 水的 b 状态。2 如果你要用 DEPC 水处

10、理 Tips 等等东东，那么就要用高压前的水，即 DEPC 水的 a 状态。把枪头管子等完全浸泡至少 8 小时，我一般都是过夜的，或者平时就泡在里面备用。RNA 提取必须创造无 RNase 的环境，所有仪器与试剂均按照以下方法进行处理 ：研钵、研棒、药匙、玻璃器皿等需在 180烘干 4h 以上； 电泳槽、胶板、梳子、用 0.1 %0.2%DEPC 水处理过夜或者用洗涤灵清洗干净后用 0.5%的 SDS (Sodium dodecyl sulfate，抑制 RNase 的活性) 浸泡过夜，然后用 ddH2O 冲洗干净，晾干备用；离心管，枪头等塑料器皿要用 0.1%0.2%DEPC 水处理之 后(

11、DEPC 有致癌之嫌，须小心操作)。37保温 12h 以上，然后高压灭菌，灭活 DEPC ( Diethypyrocarbonate )；溶液都需用经 DEPC 处理过的水配置， RNA 提取的所有操作应尽可能在超净工作台上进行。 我们研究所里提 RNA 用的枪头和 EP 管都是高压两遍的，没有用 DEPC 水处理。1、 有灭菌过的 DEPC 水，这一般是用来配 75%乙醇用，因为乙醇若高压灭菌会挥发，所以乙醇是新开封专用的。2、 没有经高压灭菌的 DEPC 水，这主要是用于配你提 RNA 所用的其他试剂（所说的试剂是可以经高压灭菌的） ，总的来说，都得经过高压灭菌，目的就是要去除 DEPC，

12、以防止它以随后实验的干扰。3、 DEPC 处理水：无菌蒸馏水中加入 0.1%(v/v)焦碳酸二乙酯（ DEPC） ，室温搅拌 4 小时以上，121 度高压灭菌 20 分钟，冷却备用。 凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用 0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC) 水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC 是 RNA 酶的化学修饰剂,它和 RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC 与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。 试验所用试剂也可用 DEPC 处理,加入 DEPC 至 0.1%浓度,然后剧烈振荡 10 分钟,再煮沸 15 分钟或高压灭菌以消除残存的 DEPC,否则

13、DEPC 也能和腺嘌呤作用而破坏 mRNA 活性。但 DEPC 能与胺和巯基反应,因而含 Tris 和 DTT 的试剂不能用 DEPC 处理。Tris 溶液可用 DEPC 处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌,可用 DEPC 处理水配制 ,并尽可能用未曾开封的试剂. 为啥在 28s 之后还是有影影约约的片断？和模糊的 smear？这都与非变性电泳方式有关。RNA 的电泳，严格讲是要使用变性电泳的，我们平时所知道的 RNA 电泳的知识，实际上都是由变性电泳获得的。但因为非变性电泳实在是太方便了，同时，就一般检测而言，完全可以替代变性电泳，所以我们日常检测就都使用非变性电泳了。电泳时

14、间太长了容易产生降解。最好是在 120V 左右。操作的时候有没有注意戴口罩和手套，注意，手套要经常换，不要太节约了。那样也会影响 RNA 的质量。无论你是提什么RNA 只要是用异丙醇沉淀的，都得用 75的酒精洗涤一次。1 样品不要太多，抽提务必充分，室温放置 5min；2 200ul 氯仿 剧烈振荡 20s，室温放置 215min ；3 13000g 离心 15min;4 取上层水相,一般 400-450ul 就足够了，千万不要贪多！*5 加入 500ul 异丙醇 摇匀，室温放置 10min； 6 12000g 离心 10min；7 75乙醇 1000ul 洗涤沉淀；8 7500g 离心 5m

15、in；（12000 转速太高了吧，沉淀不容易溶解的）9 弃乙醇，吸干净残余的微量乙醇， 室温干燥 35min；（时间太久沉淀不易溶解）10 适量 DEPC 水溶解沉淀。电泳的上样量 1ug，电泳 buffer 用 DEPC 处理的水配制，电泳时间不要太久，95V，1015min 足够了。建议跑 RNA 电泳。先用 2琼脂糖胶，若分离效果不好，可用甲醛变性胶。在上样缓冲液中注意加入 RNA 酶抑制剂。注意观察带形，质量较好的 RNA 亮度 。28S:18S 应为 2:1。还要注意观察，在加样孔或刚出加样孔附近，有没有带， 若有，可能为基因组 DNA 污染。 OD 值只有 1.5，可能为基因组 D

16、NA 污染。参考一下分子克隆 3。上面有 OD 值与污染 DNA的关系。建议，酚氯仿抽提后，上清可少吸一些。提取后的 RNA 样品可用无 RNA 酶的DNA 酶消化一下。注意该酶的 buffer 中有一种物质在 OD260 有吸光度，应严格按照其protocol 操作，减少误差。 只要用 DEPC 处理过的水，打开一瓶新的无水乙醇（或者专用于 RNA 的， 即只用处理过的枪头取过乙醇的）配就可以了。DEPC 高温高压时变成 CO2 和水，再加上乙醇也很容易气化，可能是因为有气体产生吧，如果盖子太紧容易发生瓶子破掉的事情。 （我还从来没有听说过把乙醇高温灭菌过）而且，湿热灭菌本身不足以去除 RNA 酶，所以我觉得有时候，灭菌可能反而引入 RNA 酶污染也不一 定哦