国家自然基金标书-终稿.doc

1、报告正文立项依据与研究内容（4000-8000 字）： 1、 项目的立项依据随 着 机 械 通 气 、 表 面 活 性 物 质 替 代 疗 法 等 新 技 术 应 用 ， 危 重 新 生 儿 、 尤 其 是 早 产儿 存 活 率 已 显 著 提 高 。 然 而 ， 长 时 间 吸 入 高 浓 度 氧 ， 幸 存 者 易 发 生 肺 部 氧 化 应 激 损 伤 。目 前 ， 高 氧 肺 损 伤 已 成 为 发 达 国 家 NICU 最 为 棘 手 的 问 题 之 一 和 婴 儿 慢 性 肺 疾 病 的 最常 见 形 式 。 但 高 氧 肺 损 伤 的 确 切 机 制 尚 未 完 全 阐 明 ，

2、更 无 有 效 的 防 治 手 段 。 因 此 深 入研 究 其 发 病 机 制 ， 积 极 防 治 高 氧 肺 损 伤 ， 具 有 优 生 优 育 、 提 高 人 口 素 质 的 战 略 意 义 。高 氧 肺 损 伤 是 一 个 涉 及 许 多 细 胞 活 动 的 复 杂 过 程 ， 可 分 为 早 期 的 组 织 损 伤 （ 弥散 性 肺 泡 炎 ） 和 晚 期 的 损 伤 后 修 复 （ 肺 间 质 重 构 ） 两 个 过 程 。 细 胞 外 基 质 （ extracellular matrix,ECM） 的 重 建 参 与 了 高 氧 肺 损 伤 的 整 个 病 理 过 程 ， 若 E

3、CM 重 建 正 常 ， 则 损 伤 完全 修 复 ， 肺 结 构 正 常 ； 若 ECM 重 建 紊 乱 ， 将 导 致 肺 纤 维 化 。 因 此 ， ECM 重 建 是 关 系 高氧 肺 损 伤 结 局 的 关 键 因 素 。 本 实 验 室 在 国 内 外 率 先 开 展 了 对 早 产 大 鼠 高 氧 肺 损 伤 中基 质 金 属 蛋 白 酶 （ matrix metalloproteinases， MMPs） 和 其 抑 制 剂 (tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)表 达 的 研 究 ， 已 发 现 肺 损 伤 时 MMPs

4、过 度 表 达 、 MMPs/TIMPs失 衡 是 ECM 重 建 紊 乱 发 生 纤 维 化 的 关 键 原 因 1（ 具 体 研 究 成 果 见 研 究 基 础 栏 ） 。 有关 MMPs 在 高 氧 肺 损 伤 中 的 作 用 已 为 少 数 国 外 学 者 所 重 视 ， 但 高 氧 肺 损 伤 后 ECM 重 建过 程 中 ， 引 起 MMPs 过 度 增 加 的 具 体 机 制 是 什 么 ？ 本 实 验 室 拟 从 MMPs 的 诱 导 剂 和 抑制 剂 两 方 面 深 入 研 究 。细 胞 外 基 质 金 属 蛋 白 酶 诱 导 剂 （ extracellular matrix

5、 metalloproteinase inducer,Emmprin） 在 上 调 MMPs 表 达 中 起 关 键 作 用 。 Emmprin 是 分 子 量 为 58KD 的 质 膜糖 蛋 白 ， 具 有 酪 氨 酸 蛋 白 激 酶 活 性 ， 不 仅 表 达 于 正 常 组 织 ， 还 表 达 于 肿 瘤 组 织 如 肺 部肿 瘤 细 胞 ， 提 示 Emmprin 参 与 体 内 生 理 及 病 理 过 程 2。 目 前 ， 少 数 文 献 已 证 明 ， 体外 Emmprin 与 人 成 纤 维 细 胞 共 培 养 后 ， 成 纤 维 细 胞 MMPs 表 达 增 加 。 进 一 步

6、 研 究 表 明 ，Emmprin 在 细 胞 表 面 与 自 身 受 体 或 MMP 结 合 ， 激 活 胞 内 MAPK p38 信 号 通 路 ， 该 途 径激 活 促 进 ECM 降 解 3， 4。 但 关 于 Emmprin/MAPK p38 对 MMPs 调 节 的 研 究 仅 限 于 肿瘤 细 胞 ， 有 关 高 氧 肺 损 伤 后 肺 ECM 重 建 过 程 中 ， Emmprin 如 何 调 控 MMPs/TIMPs 平 衡 ，目 前 国 内 外 尚 无 文 献 报 道 。转 化 生 长 因 子 （ Transforming growth factor beta, TGF-

7、） 在 下 调 MMPs 表 达 中起 关 键 作 用 。 研 究 证 明 TGF- 刺 激 可 使 肺 成 纤 维 细 胞 MMPs 生 成 减 少 5。 另 有 研 究发 现 ， TGF- 抑 制 元 件 位 于 MMP-1 基 因 启 动 子 区 ， 严 密 调 控 MMP-1 在 不 同 生 理 和 病理 情 况 下 的 表 达 6。 进 一 步 的 研 究 表 明 ， TGF- 对 MMP-1 的 作 用 通 过 SMAD 信 号 途径 介 导 ， 该 途 径 激 活 可 阻 止 ECM 降 解 5。 因 此 ， 推 测 TGF- /SMAD 对 MMPs/TIMPs平 衡 的 调

8、节 可 能 是 影 响 肺 损 伤 后 ECM 重 建 的 关 键 因 素 之 一 。 有 关 高 氧 肺 损 伤 后 肺ECM 重 建 过 程 中 ， TGF- 如 何 调 控 MMPs/TIMPs 平 衡 ， 目 前 国 内 外 尚 无 文 献 报 道 。近 年 来 对 信 号 转 导 系 统 的 研 究 发 现 ， 位 于 大 多 数 细 胞 质 膜 上 约 50-100nm 大 小 的囊 性 凹 陷 结 构 小 窝 （ caveolae） ， 是 许 多 信 号 分 子 完 成 跨 膜 信 号 转 导 的 “驿 站 ”。 小窝 蛋 白 （ caveolin） 是 小 窝 胞 浆 面 包

9、 被 的 一 种 21-24kD 的 膜 蛋 白 ， 是 许 多 信 号 分 子 活性 状 态 的 重 要 调 节 者 。 在 无 胞 外 信 号 刺 激 下 ， caveolin 通 常 与 富 集 于 小 窝 质 膜 上 的 各种 信 号 分 子 、 受 体 及 非 受 体 型 酪 氨 酸 激 酶 等 相 结 合 ， 抑 制 这 些 信 号 物 质 的 活 性 ； 在 激动 剂 与 受 体 结 合 后 ， caveolin 分 子 构 象 发 生 变 构 或 共 价 修 饰 ， 调 节 信 号 物 质 的 活 化 状态 ， 参 与 信 号 转 导 调 控 7。 有 关 caveolin 在

10、肺 ECM 重建中的作用，有学者提出肺泡 型上皮细胞 caveolin 表达缺失可能是发生肺纤维化的亚细胞指标。对 caveolin-1基因敲除小鼠的研究，肺组织显示肺泡隔因细胞增殖而增厚和肺纤维化。caveolin-1 在肺发育的不同阶段，可表达于不同血管和上皮细胞，呈时相分布8。研 究 发 现 ，caveolin 1 与 TGF- 型 受 体 （ T R ） 相 互 作 用 ， 抑 制 TGF- 介 导 的 SMAD-2和 下 游 分 子 的 磷 酸 化 ， 从 而 调 节 信 号 转 导 9。 Emmprin 具 有 酪 氨 酸 蛋 白 激 酶 活 性 ， 且其 信 号 传 导 为 酪

11、氨 酸 磷 酸 化 依 赖 的 MAPK p38 途 径 ， 申 请 者 推 测 caveolin 能 与Emmprin 相 互 作 用 ， 调 控 Emmprin 介 导 的 MAPK p38 和 下 游 分 子 的 磷 酸 化 。 简 图 如 下 ：基 于 上 述 ， 申请者提出如下假设：高氧暴露下 MMP 诱导剂/抑制剂失衡是高氧肺损伤 MMPs 增加，ECM 重建紊乱的主要原因。高氧暴露使质膜小窝表达或功能异常，从而影响 Emmprin/MAPK p38 和 TGF-/SMAD 两条信号通路整合，继而导致 MMPs 增加，ECM 重建紊乱。参考文献7. Ramirez MI, Poll

12、ack L, Millien G, et al. The alpha-Isoform of Caveolin-1 Is a Marker of Vasculogenesis in Early Lung Development. J Histochem Cytochem 2002;50(1):33428. Drab M, Verkade P, Elger M, et al. Loss of caveolae, vascular dysfunction, and pulmonary defects in caveolin-1 gene-disrupted mice. Science 2001;29

13、3(5539):244952胞 外 信 caveolin +? caveolin/Emmprin 作 用 Emmprin/MAPK p38号 刺 激 变 构 活 化 + caveolin/TR 作 用 TGF-/SMAD 信 号 整 合 调 控 肺 ECM 重 建 本人所在的研究室属呼吸系统疾病重点实验室。多年来，本人一直致力于新生儿高氧慢性肺损伤的研究，已成功建立了早产大鼠高氧肺损伤的动物模型、掌握了支气管肺泡灌洗术、体外型肺泡上皮细胞和成纤维细胞培养、核酸、蛋白分析等技术，并对抗氧化酶、细胞因子水平、一氧化氮、M MPs/TIMPs 失 衡 等因素在高氧肺损伤发病机制中所起的作用进行了较深

14、入的研究，同时应用地塞米松、维甲酸、人类重组促红细胞生成素、EGb761 进行了抗氧化损伤的干预研究（见研究基础栏） 。这些理论研究和技术方法的积累为本课题的开展奠定了坚实的基础。 本研究如能完成，可望为探索高氧肺损伤后肺ECM 重建紊乱的机制开拓新思路，并为寻找有效的预防和干预高氧肺损伤提供依据。 1. Taylor PM, Woodfield RJ, Hodgkin MN et al.Breast cancer cell-derived EMMPRIN stimulates fibroblast MMP2 release through a phospholipase A(2) and 5

15、-lipoxygenase catalyzed pathway. Oncogene 2002 Aug 22;21(37):5765-722. Liang L, Major T, Bocan T.Characterization of the promoter of human extracellular matrix metalloproteinase inducer (EMMPRIN). Gene 2002 Jan 9;282(1-2):75-863. Lim M, Martine T, Jablons D. Tumor-derived EMMPRIN(extrocellular matri

16、x metalloproteinases inducer) stimulates collagenase transcription through MAPK p38. FEBS Lett 1998;441(1):88924. Yuan W, Varga J. Transforming growth factor-beta repression of matrix metalloproteinase-1 in dermal fibroblasts involves Smad3. J Biol Chem 2001;276(42):38502-105. White LA, Mitchell TI,

17、 Brinckerhoff CE. Transforming growth factor beta inhibitory element in the rabbit matrix metalloproteinase-1 (collagenase-1) gene functions as a repressor of constitutive transcription. Biochim Biophys Acta 2000 Feb 29;1490(3):259-686. Razani B, Zhang XL, Bitzer M, et al. Caveolin-1 regulates TGF-b

18、eta/SMAD signaling through an interaction with the TGF-beta type I receptor. J Biol Chem 2001;276 (9):672767382、 项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。研究目标：建立早产大鼠慢性高氧肺损伤模型，探讨 Emmprin 与 TGF- 调节失衡是否为高氧肺损伤 MMPs 增加，ECM 重建紊乱的主要原因；探讨小窝蛋白对 Emmprin/MAPK p38和 TGF- /SMAD两条信号通路整合的影响，为高氧肺损伤发生机制和寻找有效防治措施提供理论依据。研究内容：1. Emmprin

19、/MAPK p38 信号通路活化状 态及高氧肺损伤 所致 ECM 重建紊乱的相关性： 研究高氧肺损伤不同时间点肺组织中 Emmprin、P38、磷酸化 P38 的表达。 研究高氧肺损伤 Emmprin/MAPK p38 信号通路活化状态与 MMPs 表达双变量关系。2. TGF-/SMAD 信号通路活化状态及高氧肺损伤所致 ECM 重建紊乱的相关性： 研究高氧肺损伤不同时间点肺组织中 TGF-、TR、SMAD、磷酸化 SMAD 的表达。 研究高氧肺损伤 TR 的激酶活性，计算磷酸化 SMAD 与非磷酸化 SMAD 比值。 研究高氧肺损伤 TGF-/SMAD 信号通路的活化状态与 MMPs/TI

20、MPs 的双变量关系。3. caveolin-1 对 Emmprin/MAPK p38 和 TGF-/SMAD 两条信号通路及其与高氧肺损伤所致 ECM 重建紊乱的相关性 ： 研究高氧肺损伤不同时间点肺组织中 caveolin-1 表达及酪氨酸磷酸化水平。 研究高氧肺损伤肺组织质膜小窝内 caveolin-1 与 Emmprin 的共定位。 研究高氧肺损伤肺组织质膜小窝内 caveolin-1 与 TR 的共定位。拟解决的关键问题：1. 成年动物急性高氧肺损伤模型，因其肺发育已成熟，不能如实反映不成熟肺的损伤情况，并且与临床上早产儿需长期用氧情况差异较大。本项目采用早产大鼠慢性高氧肺损伤模型，

21、能更如实模拟支气管肺发育不良的发生情况。虽然此模型技术难度较大，但本研究组在早产大鼠模型制备方面已积累了丰富经验，能成功完成此模型的复制。2. 本研究假设 caveolin 与 Emmprin 的相互作用可调控 Emmprin/MAPK p38 信号通路活化；caveolin-1 与 TR 的相互作用可调控 TGF-/SMAD 信号通路活化。以往由于技术条件限制，未能从形态学上直接证实。借助共聚焦显微镜观察和荧光双重标记技术可解决这一技术难题。3、 拟采取的研究方案及可行性分析。研究方法：本课题采用共聚焦显微镜（confocal microscope） 、免疫荧光双重标记和免疫组织化学等研究方

22、法，辅以蛋白质与核酸分析技术（Western Blot、Northern Blot 方法） ，检测各指标的动态变化，并对各指标进行定位、定性、定量分析。1.建 立 早 产 大 鼠 慢 性 高 氧 肺 损 伤 模 型 ： 参照申请者著作，实用儿科临床杂志，.检测 caveolin-1 酪氨酸磷酸化水平：应用抗 caveolin-1pAb 进行免疫沉淀应用抗磷酸化酪氨酸 mAb 进行 Western Blot 分析. 检测肺组织 中 Emmprin、P38、磷酸化 P38 、TGF-、TGF- 型受体（TR）及SMAD-2、磷酸化 SMAD 表达，探 讨高氧肺损伤所致 ECM 重建紊乱的分子机制：

23、 蛋白质水平检测Western Blot。 mRNA 水平检测Northern Blot（或 RT-PCR） 。. 检测肺组织中 TR 的激酶活性： TR 分离提取免疫沉淀法（immunoprecipition） TR 与纯化的激酶底物 GST-SMAD2（由美国国立癌症研究机构 de Caestecher, M 教授提供）反应，应用免疫印迹法检测磷酸化 SMAD2 水平，计算TR 的激酶活性。. 检测肺组织质膜小窝内 caveolin /Emmprin 及 caveolin-1/TR 的共定位及表达：样本制备： 制备组织切片加入抗 caveolin mAbPE 标记的二抗加入抗Emmprin

24、/TR 的 pAbFITC 标记二抗 共聚焦显微镜（TCSSP 型，德国 Leica 公司）检测共定位；应用图象分析软件对 caveolin 表达强度进行半定量。应用统计学方法处理数据：应用 SAS 统计分析软件，对数据进行统计学分析。技术路线：早产大鼠高氧肺损伤模型caveolae caveolin 酪氨酸磷酸化状态（免疫沉淀、免疫印迹）Emmprin/MAPK p38 TGF-/SMAD信号通路研究 信号通路研究Emmprin、P38、磷酸化 P38 TGF-、TR、SMAD、磷酸化 SMAD表达（免疫印迹与 Northern Blot 表达（Western Blot 和 Northern

25、 Blot）或 RT-PCR) TR激酶活性（免疫沉淀和免疫印迹）可行性分析：1. 申请者所在的研究室属于呼吸系统疾病重点实验室临床二室，本室在慢性阻塞性肺疾病和肺纤维化发病机制的研究领域已有大量工作积累，为本项目的研究打下了良好的工作基础。申请者及所在研究室在产儿高氧损伤领域进行了一系列开拓性研究，已熟练掌握急、慢性高氧肺损伤模型复制，蛋白、核酸分析等技术。 （详见研究基础栏）2. 本项目研究的主要成员之一，香港合作者教授，是国际上新生儿肺损伤研究的前沿科学家，目前与本研究小组密切合作，进行有关慢性肺损伤研究。霍泰辉教授除承担实验指导，并提供部分试剂。3. 新一代共聚焦显微镜具有观察亚细胞结

26、构的立体定位功能，用其检测在体组织caveolin/Emmprin、caveolin/ TR信号分子在亚细胞位点的共定位表达，虽无文献报道，在技术上难度较大，但申请者已掌握了多种荧光标记技术，应用共聚焦显微镜观察 caveolin-1 在细胞质膜上的定位表达也已获成功。申请人所在单位的医学中心的共聚焦显微镜和本实验室的基本研究设备，能保证本实验研究完成。4、 本项目的特色与创新之处。理论上的创新： 研究 Emmprin/MAPK p38 信号通路在器官发育和组织病理损伤中的作用,国内外尚无文献报道。 本课题研究 caveolin 对 Emmprin/MAPK p38、TGF-/SMAD 共调节

27、机制，将为早产儿高氧肺损伤发病机制开辟新的研究领域，并为其防治开拓新思路。方法上的创新：以在体组织为研究对象，应用免疫荧光双重标记共聚焦显微镜技术研究caveolin/Emmprin、caveolin/TR 共定位，国内外未见文献报道，可望为深入研究小窝蛋白对信号转导的调控机制开辟新途径。5、 年度研究计划及预期研究结果。年度研究计划及预测进展本课题研究内容预计用 3 年时间完成.2004 年 1 月8 月购买所需试剂。建立预实验动物模型。进行各项预实验。2004 年 9 月2005 年 2 月 建立动物模型。完成标本的收集。2005 年 3 月7 月 完成 MMPs、TIMPs、TGF-、T

28、R、SMAD2 及其 mRNA 表达的研究，并进行阶caveolin/Emprin 共定位 (荧光双标记、共聚焦显微镜)caveolin/ TR共定位 (荧光双标记、共聚焦显微镜)段性总结。2005 年 8 月2005 年 12 月 完成 caveolin-1 表达和 caveolin-1/TR 共定位研究，并进行阶段性总结。2006 年 1 月2006 年 6 月完成 caveolin-1 的酪氨酸磷酸化状态研究，并进行阶段性总结。 2006 年 7 月12 月 研究数据资料分析、总结、论文撰写及成果鉴定。预期研究成果本项目所建立的早产新生大鼠慢性高氧肺损伤模型，不仅为本课题提供了研究对象，

29、而且为研究高氧肺损伤后肺 ECM 重建提供了模型。本研究可望为阐明早产儿高氧肺损伤机制提供新的线索：高氧暴露下 MMP 诱导剂/抑制剂失衡是高氧肺损伤 MMPs 增加，ECM 重建紊乱的主要原因。高氧暴露使质膜小窝表达或功能异常，从而影响 Emmprin/MAPK p38 和 TGF-/SMAD 两条信号通路整合，继而导致 MMPs 增加，ECM 重建紊乱。本研究内容也可能为预防和干预高氧肺损伤提供理论依据。（二）研究基础与工作条件1、 工作基础1. 与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩本课题组多年来一直进行高氧肺损伤的发病机制及防治的研究，做了许多基础和临床研究工作。已成功建立早

30、产新生大鼠高浓度氧（85%95%）急性肺损伤和慢性肺纤维化的模型；已完成肺组织中各种抗氧化酶活力、羟脯氨酸含量与肺纤维化的相关性研究；内源性一氧化氮在高氧肺损伤中双重作用的研究；体外高氧对肺泡巨噬细胞分泌 IL-8 的影响研究；TGF- 在早产大鼠高氧肺损伤肺组织中表达的研究；基质金属蛋白酶及其抑制剂在高氧肺损伤中的作用机制的研究；及促红细胞生成素、地塞米松、维甲酸对新生鼠高氧肺损伤的干预研究。获奖课题目前正承担的相关科研项目：1. 2. 相关研究工作发表的文章：附：基质金属蛋白酶及其抑制剂在高氧肺损伤中的作用1. 高氧组病理学改变 2. 高氧组 MMPs 表达 图 1 肺发育不良，示肺泡 图

31、 2 细胞增生、间质纤维 图 3 MMP-2 强阳性表达数目减少、结构简单 化改变3. 酶谱法测 BALF 中明胶酶活性 4. 高氧暴露后 MMPs、TIMPs 表达增加 MMP-2 MMP-9 TIMP-1 TIMP-23d O2 0.460.36 0.900.64 2.000.47 0.300.23air 0.070.10 0.070.16 0.870.58 0.030.087d O2 1.330.60 0.110.45 2.600.71 1.150.34air 0.360.43 0.170.35 1.700.35 0.060.1014d O2 3.400.53 2.750.66 3.37

32、0.45 2.430.18air 1.300.90 0.330.31 2.820.89 0.080.1021d O2 3.730.46 3.350.60 3.880.11 1.900.38air 0.300.14 0.600.10 2.540.55 0.300.14图 4 高氧组条带亮度增强，示活性增强 高氧组与对照组比较均 P0.05 2、 工作条件1) 研究所需实验动物，均有实验合格证。2) 申请者所在医院的分子医学中心设备可协助完成 Western blot 、northern blot、免疫沉淀等实验。3) Caveolin-1 抗体由 Division of Hematology/O

33、ncology/BMT Department of Pediatrics Emory University School of Medicine 教授有偿提供。本项目所需的其它抗体、分子探针和试剂国外均有售，或由合作者 Fok TF 赠送。总之，申请人所在的医院及大学的实验条件，完全能够满足该项目的研究要求。3、 申请人简历4、 承担科研项目情况1 由本项目申请者负责。 主要探讨 EGB761 对高氧肺损伤早产新生大鼠支气管肺泡灌洗液中细胞因子如 TNF-、IL-8，IL-1、IL-6、MMPs、TIMPs 及其 mRNA 的影响。2早产儿贫血临床治疗的研究 由本项目申请者负责。3支气管肺泡灌洗技术在新生儿肺部疾病中的应用研究 “新技术、新业务”资助项目。