电穿孔SCIENTZ-2C说明书.doc

1、第 页1SCIENTZ-2C 基因导入仪使用说明书宁波新芝生物科技股份有限公司地址：宁波市科技园区木槿路 65 号 315013电话：0574-87134807 87133995 传真：0574-87113393 Http/： E-mail:SCIENTZ-2C 基因导入仪使用说明书第 页2一、概述高压脉冲基因导入仪，广泛用于植物、动物和各种微生物的各类细胞电穿孔，可以进行细胞杂交、细胞融合，基因导入的研究。本系统结构紧凑，采用电脑(CPU) 控制, 使用方便,安全可靠。注意：1. 本仪器为高压装置，使用仪器前请仔细阅读说明书，必须按说明书方法安装和使用。2 .在各项准备工作完成后再开机，使用

2、完后须及时关机, 避免长时间空开；充完电后，应及时进行导入操作或者放电，避免长时间处于充电状态。3 .防止液体溢出洒在仪器上。二、原理仪器的组成本仪器由 SCIENTZ-2C 基因导入仪主机和基因导入杯及专用连接线等组成。电路构成由控制电源、高压电源、高压整流、储能电容（有高压电容和低压电容）、并接电阻、充放电回路、CPU 控制、显示电路以及导入杯（溶池）等部分组成。如图：高压电源 高压整流 电子开关 储能电路 放电回路 导入杯电源 分压取样 并接电阻选择 控制电源 CPU 控制电路工作原理导入杯（溶池）内放置经过适当处理的细胞溶液（含基因），接入仪器的高压脉冲输出端，选择适当的电能量（ ）：

3、由储能电容和储能电压的平方乘积确定），选择适当的CU2放电阻抗（以 RC 放电时间常数作参考）以瞬间放电（指数式衰减）的形式可逆击穿细胞壁，达到基因导入细胞之目的。 三、技术参数高压储能电容高压储能电容CPU 控制电路显示电路电子开关电子开关第 页31、储能电容A.高压储能电容：1F、5F、25F 以及它们的组合如 6F、26F、30F 和 31F 共七档，自由设置；B.低压储能电容：2 5F、 50F、 100F、 200F、 400F、 800F 以 及 它 们 的 组 合 如125F、 150F、 175F、 200F -直至 1575F 共 63 档 自由设置. 最小 25F, 以 2

4、5F 为 步 长递 进 ；2、储能电压A.使用高压储能电容时，储能电压可从 401V2500V，自由设置,精度为 1V；B.使用低压储能电容时，储能电压可从 10V400V，自由设置，精度为 1V；3、放电并接电阻：50(固定)、50、100、200、400、800 和以及它们的组合如 50、100、150 直至 1600 共 32 档，自由设置。最小 50 最大1600, 以 50 步进. 另有无穷大档可供选择.4、使用电源：单相 220V，50HZ，100W。静态 RC 放电时间常数（RC 理论值，忽略细胞溶液阻抗）以下测试条件（低压：300V，高压：2000V）RC(ms)R()C(f)

5、1.0 5.0 25.0 100 200 400 600 800 1000 150050 0.05 0.25 1.25 5 10 20 30 40 50 75100 0.10 0.50 2.5 10 20 40 60 80 100 150200 0.20 1.0 5.0 20 40 80 120 160 200 300300 0.30 1.5 7.5 30 60 120 180 240 300 450400 0.40 2.0 10.0 40 80 160 240 320 400 600500 0.50 2.5 12.5 50 100 200 300 400 500 750600 0.60 3.

6、0 15.0 60 120 240 360 480 600 900700 0.70 3.5 17.5 70 140 280 420 560 700 1050800 0.80 4.0 20.0 80 160 320 480 640 800 12001000 1.00 5.0 25.0 100 200 400 600 800 1000 15001500 1.50 7.5 37.5 150 300 600 900 1200 1500 2250（注：在高压放电时，实际的 RC 常数要远小于上表的参考值）第 页4四、仪器面板、后板结构及功能1.前面板2.后面板五. 参数设置步骤（一）开机后液晶 LCD

7、显示 0，此时按“C”键进入设置界面（如下图所示）图 5.1 按“C”后进入设置界面（二）参数设置、电压参数设定（U）电源插座宁 波 新 芝 生 物 科 技 有 限 公 司NINGBO SCIENTZ BIOTECHNOLOGY CO.,LTDOUT电 源 插 座3A保 险 丝生 产 日 期 ， 产 品 编 号第 页5a.进入设置界面后，按电压设置键“U”，进入电压设置窗口（如下图所示），可以输入所需的电压值。 b.按“PT”键确认（参数被确认后，电压数组中会出现“.”）。如输错可按“0”按钮清除数据后，重新输入再次按“PT”键确认即可；或者多次按“0”键，直至显示区域只显示 0；图 5.2_

8、1 设置电压第二组参数 200V，按“PT”调用c.在电压设置界面中，可按“U”键来切换预存参数（U1 到 U5 共 5 组参数），按“PT”键即可调用（参数被调用后，电压数组中会出现“.”）；d.被调用的该组参数，经过导入动作后，会覆盖原先改组的参数，下次只需调用该组参数，而无需再此输入、电阻参数设置（R）按“R”键进入电阻参数设置，设置基本设置方法，跟电压设置方法一样，设置范围为 501600 欧姆（每 50 欧步进）电阻也 R1R5 五组参数，也可保存和调用预存参数；、电容参数设置（C）按“C”键进入电容参数设置，设置方法同上，电容设置分为高压储能电容和低压储能电容两种（具体设置方法再下

9、文设定数据的范围介绍）（三）、设定数据的范围电压、电容和电阻三个参数的设定范围各不相同，下面分别作说明。1、电压：设定范围为 502500 伏,辨别率为 1 伏。低压 50-400V, 高压 401-2500V.2、电容：分为高低压两档，高压分为:1,5,6,25,26,30,31F 共七档。低压从 25F 开始到1575F，每 25F 步进一档，且只有当设定的数值达到或超过该档时才会有效。3、电阻：电阻的设定范围为 501600 欧姆(每 50 欧姆步进一档) 另有无穷大档(设 0即为该档). 设置时,只有设定的数值达到或超过该档时才会有效。（四）导入操作第 页6、电压（U）电阻（R）电容（

10、C）设置完后，就可以按“RD”键进行储能(过程如下图所示)图 5.2_2 存能过程（从 1%到 99,当到达 99%即表示储能完成）5、储能完成（界面显示“L 99”），按“RD”即进行导入动作6、导入动作后，界面会显示本次导入时间（时间常数），如下图所示图 5.2_3 时间常数显示5、导入动作后，需按“U”键返回到设置状态中，来进行新的设置；如无需根改参数，直按“RD”键，仪器按前一次设置进行储能注意事项：1、每一个数字键按下都有“嘀”的声音提示，如没有声音则表示按钮并未完全按下，输入无效。2、如听到“嘀”、“嘀”两声提示音则表示输入数据超出范围需重新输入（在设定电容、电阻参数时）。六、使用

11、注意事项1、仪器若长期未使用在重新使用时，应先低压充电、放电，逐步升高电压，直至额定值。在仪器使用时,应先通电予热 10-15min,设置数据,进行几次充电放电空操作后,才可正式进行导入操作。2、仪器的输出连接线、接线座等处在放电时有高电压、大电流存在。故在使用时，应避免与人体、导体（如液体）或易受干扰的电器等接触、靠近。3、 仪器内有高电压（2500V）存在，非专业人员，不得打开检修。如有故障请与我单位有关技术人员联系。毫 秒十 毫 秒百 微 妙 十 微 秒百 微 秒秒第 页74、 实验中如果出现溶池发生弧光,溶液爆溅出来说明电压设置太高或电容太大,应相应降低电压、电容的设置值。七 新芝基因

12、导入仪实验参考技术参数品种 电压 电容 电阻 导入盒 转化率 反馈用户名酵母 1200-1500V 25F 200-400 2mm 2.2-3.2*102cfu/ug DNA 上海肺科医院大肠杆菌 1250V 5F 400-1000 1mm 107-108cfu/ug DNA 清华大学大肠杆菌 1100V 10F 500 1mm 2500cfu/ug DNA 清华大学大肠杆菌 1500V 25F 400 2mm 2500cfu/ug DNA左右 解放军总医院羊细胞 250V 500F500 4mm 102cfu/ug DNA 中科院发育所毕赤酵母 1500V 25F 400 2mm 1.8x1

13、03cfu/ug DNA 华东师范大学枯草芽孢杆菌1250V 25F 400 2mm 102cfu/ug DNA 华东师范大学（因各单位实验条件不尽相同，以上实验参数仅供参考）八 操作过程1、按上图所示，连接好仪器电源、导入盒（接输出插孔）等。 2、将配有相应细胞液的导入杯装入导入盒内（细胞液一般用双重去离子水价甘露醇或葡萄糖等，浓度为 10%20%，电阻在 3 千欧左右）。3、 打开电源开关，仪器通电，显示器有显示。按“参数设置步骤”的方法。设置实验所需的技术参数时，应先按储能电容(C)再按储能电压（U）最后按放电电阻(R)的具体数值，然后按 RD 键按一下即可，当屏幕中充电进度显示“99”

14、时，按 RD 键进行导入，听到锋鸣器响声后，此时显示屏显示的是时间常数。电脑便进行储能电压, 储能电容, 放电电阻的选取及对所选定的储能电容充电,当充电电压稳定到所设置的电压值后, 按 RD 键进行导入，立即向输出端(包括导入盒和所选定的放电电阻的并联电路)释放高压脉冲，进行有一定时间常数的放电过程，即电击穿、融合、导入过程。（选择储能电压值、电容值和放电电阻值，是为了选取恰当的电能量和放电（RC）时间常数，以期获得刚好使细胞壁可逆击穿，基因导入融合的最佳效果。这是十分重要的。因为影响因素很多，要想获得高的转换率，必须依靠自己长期实践经验的积累。第 页8）4、 若需二次放电，只要按 U，然后再

15、次按 RD 键即可。若要修改参数，则重复上述（3）的操作过程，可获得多次放电效果。5、 若停止使用，可关电源开关，切断输入电源，取出导入杯。为安全起见，应在关断电源后，再取出为妥。九、大肠杆菌基因导入（参考资料）用基因导入仪进行基因转化很有效。用生长旺盛的细胞，可使 1ug 质粒 DNA材料E coli 单菌落LB 培养基10%冰冷的甘油(丙三醇)Scientz-2C 基因导入仪含抗菌素的 LB 平板冰水SOC 培养基(0.5%酵母提取物,2%蛋白胨,10mmol/L Nacl,20mmol/L MgSO4,25mmol/L KCl,20mmol/L 葡萄糖,10mmol/L MgCl2)方法

16、（1）将 E.coli 单菌落接种于 5mlLB 培养基中,在 37下振荡培养过夜。取 2.5ml 新鲜培养液倒入 500mlLB 培养基（用 2L 三角瓶）中，在 37下振荡（300rpm ）培养至细胞对数生长期（OD600 为 0.5-0.6）。（2） 将培养物在冰水中放置 30 分钟使细胞停止生长，然后倒入预冷的离心管中，在 4下 5000g 离心 10 分钟，弃去上清液。（3） 用 100ml 预冷 10甘油重悬细胞，4 5000g 离心 10 分钟，弃去上清液。（4） 重复步骤（3）。（5） 用 5-10ml 预冷 10甘油重悬细胞，100-200l/管分装于无菌的 1.5ml ep

17、pendorf 管中，保存于-80。（6）将基因导入仪的参数调至 2.5Kv，25uF，脉冲阻抗控制在 200-1000 欧姆。（7）加入不大于 5ul 质粒 DNA(5pg-0.5ug)和步骤(5)处理的新鲜细胞或冰冻细胞（融化后置冰上）混合（增加 DNA 样品体积会盐浓度加大，易产生电弧，转化率下降）。将第 页9混合液转到预冷的导入杯中，抹去杯外冰水后放入样品槽中。（8） 释放电脉冲，取出导入杯立即加入 1mlSOC 培养基，并用吸管将菌液转至无菌小管中。在 37下，缓慢振荡培养 30-60 分钟。（9） 将上述转化细胞的培养液涂于抗菌素的 LB 平板上。注意（1）该法的关键是用适当的电压

18、、电容值和适当时间常数的电脉冲。用对数生长的细胞进行的转化效率比稳定生长期的细胞高。（2） 该法的优点是：转化效率高。尤其对一些较大的质粒，采用该法可获得较好的结果。实践已经证明，当质粒达 14kb 时，转化效率不会产生明显下降。（3） 释放电脉冲，取出导入杯立即加入 1mlSOC 培养基，并用吸管将菌液转至无菌的小管中。在 37下，缓慢振荡培养 30-60 分钟。（4） 将上述转化细胞的培养液涂于抗菌素的 LB 平板上。实验结果（使用 Scientz-2C 基因导入仪）材料: PUC18 质粒 1UL 0.1UGDNA 转化率 BL 21 2-310 JM 109 2-310 DH 5a 1

19、10 HB 101 2-310 应用举例条件：导入杯 2mm (一次性使用)电压 2.5kv 电容 25uf电阻 400-1000PUC 18 质粒转化率（BL 21 菌株）电 阻 400 800 1000转化率 110 1.510 2-310 第 页10十、装 箱 清 单1、SCIENTZ-2C 基因导入仪主机 1 台2、保险管 3A 2 只3、质量保证书（保修卡） 1 份4、合格证 1 份5、使用说明书 1 份6、2mm 基因导入盒（进口） 1 只7、电源线及连接线 各 1 副Scientz-2C 基因导入仪简易实验步骤1、收集细胞：用胰酶消化细胞，将细胞培养液吸入到 15ml 离心管中，分为 6管，900rpm 5min，弃其上清。2、用不含血清的培养液洗一次，弃上清。3、 各 取 5ul质 粒 Red 分 别 加 入 到 100ul电 缓 冲 液 中 ， 充 分 混 匀 。4、分别各用 100ul 混有质粒 Red 的电转缓冲液充分溶解细胞，转入 2mm 电转导入杯中。5、将电转导入杯放入样品槽中，释放电脉冲。6、立即取出电击杯，分别用一次性吸管将混和液转移至加有 DMEM 培养基的一次性细胞培养瓶中，放入细胞培养箱中培养。备注：为了使实验达到更好的效果可以选购晶赛公司的电转缓冲液。例：做 293 细胞，设电阻为 00，电容为 500F，电压为 250V，成活率较高。