1、紫外可见分光光度法,目 录,紫外可见光谱学原理和应用仪 器样品处理及测定方 法二极管分光光度计的特性,1.基本原理,电磁波谱：无线电波、红外线、宇宙射线、x射线、紫外线、可见光波长范围：200-800nm波长和频率： E=h =c / 越短，E越高,短波长的紫外光能量高，这种成份导致了皮肤晒黑。,紫外可见光谱的来源： 辐射作用于物质，发生反射、散射、吸收、荧光、磷光、光化学反应。通常测量紫外可见光谱时我们希望只发生吸收。分子内电子跃迁导致谱带变宽，产生吸收光谱,适用含量范围: 10-5%50%,2. 定性分析：,鉴定谱图和结构 同一性的认证 颜 色 其他定性信息 蛋白质的熔点测定 酶活性,3.
2、 定量分析：,朗伯比尔定律： A = b c (为摩尔吸光系数)多组分的分析 叠加性原理：一种混合物在任何波长下的吸光率 等与混合物中各组分在该波长下的A之和。 浓溶液的不适用性 化学偏离与仪器偏离,几乎所有金属元素的定量分析,0.01 mol/L时, 粒子相互影响 电荷分别改变. 也改变. 浓电解质中有类似效应.,化学:缔合,离解,溶剂化,PH变化等仪器:单色光不纯. 峰值处测量可改善,该方法能分析复杂的混合物和图谱相似的简单混合物。用最小二乘法计算的偏差表明了标准光谱和样品光谱的拟合程度，同时也说明了分析结果的准确性。,简单联立方程式 最小二乘法 偏最小二乘法（PLS）,关键组分的回归法（
3、PCR）,多重最小二乘法（MLS）,多组分分析方法,4. 间接测量：,化学衍生法分光广度滴定酶动力学分析,1.仪器设计,分光光度计的组成产生一定光谱宽度的电磁辐射光源色散装置：从光源发射宽的电磁波中选择特定的波长样品区域检测器:测量辐射强度,传统的分光光度计适用于测量光谱中单点吸光度,二极管阵列分光光度计比较：样品和色散元件的相对位置次序相反，称为反向光路,按构型分,单光束设计：提供高的光通量，灵敏度高；但光源漂移产生较大误差 双光束设计：矫正漂移。斩光器以一定速度旋转，使空白和样品的交替测量每秒进行数次。缺点，降低了光的能量和灵敏度 分光束设计：分裂器将光分成两束，同时穿过参比和空白，到达两
4、个分开但一样的检测器，可同时测定样品和空白 双波长设计：同时测定两个波长，如样品中两个同时发生的反应,2.主要仪器参数（可能影响吸光度测量值准确度及精确度的一些仪器参数）,光谱分辨率波长准确度及精确度 线性动态范围 漂移,SBW/NBW0.1,影响测光准确度和精确度的因素：杂散光和噪声,杂散光：检测到选定波长带宽以外的任何波长 光。 T =( I + I s ) / ( I 0 + I s )噪声光子噪声：在测量低浓度低吸光率样品时，影响精确测量两束高强度的光之间的微小差别。电子噪声：是固有的，与测定的光强度无关。在高吸光度样品的信号很小时影响大,液体样品 固体样品 弱吸收 强吸收 干扰 光化
5、学问题,动力学光谱法固相光谱法多元校正多组分测定,导数光谱法,一阶导数：,如果控制I0不变，则 ,而,结论：A信号也正比于c， 在原拐点处灵敏度最大 高阶导数光谱同样适用,导数光谱的特点：,随着导数阶数的增加，峰越来越尖锐，灵敏度提高,信噪比随导数的阶数增加而降低,原谱,一阶导数,二阶导数,二极管阵列分光光度计的特点,二极管阵列光谱学的优点二极管阵列光谱学的缺点,快速采集，多波长同时测定，灵敏度高，有统计学意义，很高的稳定性和可靠性，敞开式的样品室,分辨率较低，散射光严重，样品会分解,参考文献：Tony owen著, 现代紫外可见光谱学基础，1997，12-5965-5123E张剑荣，戚苓,方惠群编，仪器分析试验，科学出版社，1999曾永昌，向立人，周在德编，仪器分析，四川大学出版社，1992G.W.尤因著，华东化工学院分析化学教研组译，化学分析的仪器方法，1986罗国安，邱家学，王义明编，可见紫外定量分析及微机应用，上海科学技术文献出版社，1988,谢谢大家,
