RNA干预—基因组免疫学.ppt

1、RNAi基因组免疫学,王 辉新乡医学院免疫学研究中心,人和脊椎动物体内都存在着一种对抗外来病原微生物的系统，称之为免疫系统,十八世纪末，英国乡村医生Edward Jenner 从挤奶女工那里获知，感染过毒性低的牛痘病毒就不会被天花病毒感染，于是他发明了牛痘疫苗。,那么植物是否具有对抗病原微生物的能力？最近几年人们发现，植物细胞可以通过降解病毒RNA 的方式来对抗病毒的入侵，称为转录后沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS）,除转基因能诱导PTGS外，转入某些病毒同样能够诱导，提示外源基因诱导的RNA沉默是植物对抗病毒和转座子的一个防御系统。,十

2、多年前，Jorgensen和他的同事们试图加深矮牵牛花的紫色，就将一个强启动子控制下的色素基因转入，但结果非常惊奇，许多花并不是紫色而是杂色，甚至是白色。,Jorgensen称这种现象为共抑制（cosuppression），即转入的外源基因和其本身的同源基因都被抑制-出现基因沉默（silencing），后来发现许多植物都有这种现象。,1995年，Guo等想利用反义RNA技术阻断线虫（C. elegans）中的par-1基因，但却得到了一个意想不到的结果。在对照实验中给线虫注射正义RNA（sense RNA）以期观察到基因表达的增强。但得到的结果是二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。,直

3、到1998年Fire等首次揭开这个悬疑之谜。他们证实，Guo等遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。,当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达，他们将这一现象称为RNA干预（RNA interference ,简称RNAi）。,Discovery of RNAi,Double-stranded RNA,inject,C. elegans,Neg. control Uninjected,Antis

4、ense RNA dsRNA,sense,antisense,Nature 1998 391:806-811,Mex-3 mRNA detection in embryos by in situ hybridization,Examples of RNAi,hairpin against pigment,GFP expressed in nuclei,Control dsRNA,GFP specific dsRNA,Red = silencing of GFP,RNA干预的原理,体外实验表明：RNAi反应中，加入的dsRNA被切割为21-23个核苷酸长的RNA片段，后者会使目的mRNA被切割为

5、21-23核苷酸长的片段。,从已经发生RNAi的果蝇S2细胞中，Hammond等人部分纯化了一种核酸酶-Dicer，该核酸酶具有序列特异性，它仅降解与引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA。,当dsRNA导入细胞后，被一种dsRNA特异的核酸内切酶识别，切割成21-23核苷酸长的小片段，这些片段可与该核酸酶的dsRNA结合结构域结合，并且作为模板识别目的mRNA。,识别之后，mRNA与dsRNA的有义链发生链互换，原先dsRNA中的有义链被mRNA代替，从酶-dsRNA复合物中释放出来，而mRNA则处于原先的有义链的位置。,核酸酶在同样位置对mRNA进行切割，这样又产生了21-23核苷

6、酸长的dsRNA小片段，与核酸酶形成复合物，继续对目的mRNA进行切割，从而使目的基因沉默，产生RNAi现象。,这种现象至少有三种机制：1、Dicer酶将长dsRNA分子切成短的初级短RNA（siRNA）。2、siRNA在酶作用中，可多次应用，能提供进一步放大。3、短RNAs可作为靶mRNA的引物，产生后代次级siRNAs（靶序列直接扩增），并且这样启动一个RNA诱导的RNA聚合反应。,RNAi与免疫作用的比较,脊椎动物的免疫系统对于病毒等病原微生物的入侵采用两步战略：通过基因重排，使有限的基因片段组成很多抗体编码基因，各种抗体编码基因分布在大量细胞之中。感染以后，通过克隆选择和相应细胞的扩增

7、，产生针对免疫原的特异性免疫应答。,脊椎动物的免疫细胞-T、B淋巴细胞，在早期发育阶段通过阳性和阴性选择，将能识别自身抗原的克隆排除，从而解决了特异性的问题。RNAi系统的作用也具有同样的特异性，当病毒进入，只出现病毒基因的沉默现象，而机体的其它基因表达正常。,脊椎动物的免疫系统，能将局部接触的抗原的信息传播到全身。RNAi系统是否具有这种功能？在植物中，可以观察到，转录后基因沉默和病毒诱导的基因沉默是针对频繁出现的病毒感染的保护机制。这种防御系统的优势是其防御信号可以扩散，如果接种到一片树叶的一个区域，能将免疫力给予周围的细胞。,在线虫中，RNAi的最明显的特征之一是它的全身效应，在动物的一

8、个部位注射裸dsRNA可以影响其他部位基因的表达，并且dsRNA和食物一起给予通过肠腔吸收，在性腺中发现影响子代基因的表达。这种能力可以增加保护作用以防被病毒重复感染。,当病原微生物进入机体后，通过抗原处理和递呈，使相应淋巴细胞克隆活化，并发生克隆扩增，从而形成很多针对该抗原的淋巴细胞，从而有效地对抗病原微生物。在线虫中，小量的dsRNA 能够使大量的靶RNA沉默。 这种现象主要是因为Dicer酶将长dsRNA分子切成短RNA（siRNA），因为每一个siRNA具有结合一个同源mRNA的能力，效应的放大水平取决于dsRNA的长度 ，很容易检测到放大1020倍。,免疫系统的一个重要生理功能是清除

9、体内衰老的或异常的细胞，从而保持机体的生理平衡和稳定。RNAi同样具有降解体内异常基因的RNA的功能，从而使异常基因不能表达。,RNAi的在医学上的应用前景,目前，人类在对待细菌感染性疾病要比病毒感染的疾病有更多的对策，其根本原因是病毒的简单性，没有很多的靶目标和有些病毒的易变性，象流感病毒和艾滋病病毒，它们的抗原经常发生改变，使我们很难对其通过疫苗进行预防。,2002年6月份自然医学杂志，刊登了美国的科学家用短干预RNA（siRNA）的方法，使细胞表面HIV病毒结合受体-CD4的基因沉默，结果降低了细胞内病毒的拷贝数，这的确给我们最后征服艾滋病带来希望。,除此之外，也许我们根据HIV的mRN

10、A的序列，制备出双链RNA（dsRNA）作为HIV的疫苗，当它们进入细胞后可以降解HIV的mRNA，从而阻止HIV在细胞内的复制。另外，癌症的治疗同样可以用RNAi的方法，我们知道，癌症细胞之所以能无限增殖，主要与细胞内某些基因的异常表达有关，如果我们通过RNAi的手段使这些基因沉默，也许会取得很好的效果。,研究人员改良了用来进行干预疗法的RNA分子，他们把RNA分子附在一个胆固醇（apoB)分子上。当研究人员把这种改良后的RNA分子注入老鼠体内后，他们发现实验鼠体内的有害胆固醇含量下降了44。这一实验成果发表在自然杂志上。,总之，RNAi的发现，为我们了解生命和征服疾病提供了新的手段，同时也使我们对机体的免疫系统有一个更加完整的认识。,