丹参多酚酸盐对大鼠脑缺血再灌注过氧化损伤的保护作用.doc

1、1丹参多酚酸盐对大鼠脑缺血再灌注过氧化损伤的保护作用【摘要】 目的 观察丹参多酚酸盐对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后脑组织内 SOD、GSHPx 和 MDA 含量的影响，探讨其缺血脑保护的作用机制。 方法线栓法制作大鼠中动脉缺血再灌注损伤模型。SD 大鼠随机分为正常对照组、缺血再灌注组、丹参多酚酸盐低剂量治疗组（10 mg/kg）和丹参多酚酸盐高剂量治疗组（30 mg/kg） 。各组动物按要求给药，在预定时间进行神经损伤行为学评分、脑梗死体积及脑组织内超氧化物歧化酶（SOD） 、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）活性和丙二醛（MDA）含量的测定。结果 与缺血再灌注组相比，丹参多酚酸盐治疗组大鼠神经

2、损伤行为学评分及脑梗死体积减少，脑组织内 SOD、GSHPx 活性升高，MDA 含量下降，均具有统计学意义(P0.05)，且呈剂量依赖性。结论丹参多酚酸盐可通过抑制脂质过氧化反应，保护抗氧化酶的活性，从而介导神经保护作用。 【关键词】 丹参多酚酸盐；脑缺血再灌注；超氧化物歧化酶；谷胱甘肽过氧化物酶；丙二醛 文章编号：1003-1383(2010)06-0665-03 中图分类号：R 743 文献标识码：A doi:10.3969/j.issn.1003-1383.2010.06.005 2The effect of salvianolate on the peroxidation injury

3、 induced by focal cerebral ischemia reperfusion in rats WANG Qiang?1，ZHANG Yi?1，LI Lu?2，DONG Bo?1，YANG Yilin?1 (1.Department of Neurosurgery，2.Department of Clinical Laboratory， Changzhou First Peoples Hospital，Changzhou 213003，China) 【Abstract】 ObjectiveTo study the protective effect of salvianolat

4、e on the peroxidation injury induced by focal cerebral ischemia reperfusion in rats and to reveal the mechanism. Methods 48 SD rats were divided into four group randomly,they are normal control group，ischemia reperfusion group，salvianolate (10 mg/kg) group and salvianolate(30 mg/kg)group.Each group

5、contained 12 rats.The Longa method was used to establish the MCAO model.The salvianolate at different dose were injected intraperitoneally at different time point according to the test design. The brain infarct volume by TTC stain and behavior scores by Bedersons methods were also determined in orde

6、r to evaluated the protective effect.Also we 3use assay kit to determine the activities of SOD and GSHPx，content of MDA in each group. Results Comparing with the ischemia reperfusion group, brain infarct volume and behavior score of salvianolate group was lower,the activities of SOD and GSHPx of bra

7、in tissue increased,the content of MDA decreased.There was significant difference between them(P0.05)，the effect of salvianolate was dosedependent. Conclusion The salvianolate plays neuroprotective effect by inhibiting the lipid peroxidation and protect the activity of antioxidant enzyme. 【Key words

8、】salvianolate；cerebral ischemia reperfusion；SOD；GSHPx；MDA 大量证据表明氧自由基引起的脂质过氧化是脑缺血再灌注损伤的重要机制之一。缺血再灌注可使自由基连锁反应激化，大量的自由基引起细胞膜脂质过氧化，导致神经元死亡，造成严重的神经功能损害。丹参是一种传统的活血化瘀中药，在临床上被广泛用于治疗冠心病、心绞痛、缺血性中风等疾病，丹参多酚酸是其最重要的有效成分1 。已有实验证实丹参多酚酸对实验性脑缺血具有显著的保护作用2 ，但其机制尚不明确。本研究在建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型基础上，观察再灌注后大鼠神经功能、脑梗死体积及缺血脑组织内 SOD、

9、GSHPx 和 MDA 的变4化，探讨丹参多酚酸盐对局灶性脑缺血再灌注的保护作用及其机制。 材料和方法 1.动物及试剂 SD 大鼠购自苏州大学实验动物中心。注射用丹参多酚酸盐（中国上海绿谷药业，批号 20070101） ，SOD、GSHPx、MDA 试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，氯化三苯基四氮唑（TTC）购自北京化学试剂公司，其它试剂均为国产分析纯。 2.动物分组及模型制作 成年雄性 SD 大鼠 48 只，体重 230250 g，随机分为正常对照组、缺血再灌注组、丹参多酚酸盐低剂量组（10 mg/kg）及丹参多酚酸盐高剂量组（30 mg/kg） ，每组 12 只。参照Longa3法，制作

10、大鼠 MCAO 模型。大鼠以 2%戊巴比妥钠腹腔麻醉（45 mg/kg） ，颈部正中切口，分离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)。结扎 CCA 近心端、ECA 起始端后，翼腭动脉短暂夹闭以防误插，经 CCA 插入线栓（线栓为直径 0.23 mm 进口鱼线，头端涂抹石蜡4 ） ，插入深度由分叉部记(18.00.5)mm。再灌注处理为拉线栓使线头退至颈外动脉。术中维持肛温(370.5)；缺血时间 2 h，再灌注 72 h。在缺血期间及再灌注后 2 h 保持体温在（370.5）。丹参低剂量组及高剂量治疗组在术后 60 min、术后第 1 d 及第 2 d，分别将 10 m

11、g/kg 及 30 mg/kg 的丹参多酚酸盐溶于生理盐水中，腹腔注射；正常对照组和缺血再灌注组腹腔注射等量的生理盐水。模型成功的标志为大鼠手术麻醉清醒后出现左侧肢体瘫痪，站立不稳，提尾时向一侧转圈。 53.神经功能缺损评分 各组动物于苏醒后 6 h 内按照 Zea Longa 和Bederson 的方法进行评分，0 分：无神经缺损症状；1 分：右前肢不能完全伸直；2 分：向右侧旋转；3 分：向右侧倾倒；4 分：不能自己行走或昏迷。评分为 0 分、有呼吸困难、提前死亡及处死后发现有蛛网膜下腔出血的均弃之不用，手术中出血过多的大鼠亦予以剔除，并均在后续实验中补足。建模成功大鼠缺血后 24 h 再

12、次评分，将此分数录入实验结果。4.脑梗死体积的测定 每组随机选择 6 只大鼠，适时断头取脑，弃去嗅球、小脑及低位脑干。置-20冰箱中冷冻 20 min，距额极 3 mm 开始切片，每片厚 2 mm，放入 1TTC 水溶液中，37孵育 30 min。缺血区染成白色，有正常血供的脑组织为红色。染色后以 10%甲醛溶液避光保存24 小时，数码相机拍照后，应用病理图像分析仪测定梗死面积，根据公式 V=（A1+An）t/2 算出梗死体积，其中 t 为切片厚度，A 为梗死面积。5.指标测定 大鼠戊巴比妥钠麻醉后断头处死，冰盘上快速取左侧额顶叶背外侧区皮质，精确称重后用预冷的匀浆介质制成 10脑匀浆。低温高

13、速离心 15 min，取上清-70冰箱保存。严格按照试剂盒说明进行SOD、GSHPx 活性及 MDA 含量测定。 6.统计学分析 结果用均数标准差(-?s)表示，采用 SPSS12.0 统计软件包，以单因素方差分析和 t 检验作差异的显著性分析。P0.05 表示有统计学意义。 6结果 1.行为学评分 与缺血再灌注组比较，丹参多酚酸盐可以明显降低实验大鼠的行为学评分，且高剂量组降低程度较低剂量组更为显著(P0.05） 。见表 1。 2.脑梗死体积 与缺血再灌注组比较，丹参多酚酸盐可以明显减少实验大鼠的脑梗死体积，且高剂量组较低剂量组更为显著 (P0.05)。见表 1。 3.丹参多酚酸盐对脑缺血再

14、灌注损伤大鼠脑组织 SOD、GSHPx 和 MDA的影响缺血再灌注后脑组织内 SOD 及 GSHPx 活性降低，MDA 含量明显升高；丹参多酚酸盐可提高 SOD 及 GSHPx 活性，降低 MDA 含量，且高剂量组与低剂量组间有显著性差异 (P0.05)。见表 2。 讨论 缺血性脑血管病是临床常见的致死性疾病之一，对人类健康危害极大。脑缺血再灌注损伤的病理生理机制非常复杂，再灌注期产生的大量自由基导致的过氧化反应已被证实参与了脑损伤的发生。自由基是带有不成对自由电子的化学基团，性质异常活跃，易与脂质、蛋白质、核酸发生一系列过氧化反应。其既可通过损伤大分子物质导致缺血性脑损伤，也能通过信号转导途

15、径损伤脑组织。SOD 和 GSHPx 是细胞内两种主要的抗氧化酶，可增加自由基的清除，它们是体内自由基平衡的酶性调节剂，7可调动或激活机体中的内源性抗氧化系统，有利于预防或减轻自由基损伤，也是较敏感并能反映细胞抗氧化能力的观察指标。MDA 是氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用而形成的脂质过氧化物，它的量反映了体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤程度。研究证实，减少自由基的产生或增强清除自由基的能力，能产生脑保护作用5 。本研究显示丹参多酚酸盐使 SOD 和 GSHPx 活性的下降趋势得到了明显改善，脑组织中 SOD 和 GSHPx 的活性增加，同时 MDA 的含量也明

16、显降低。说明丹参多酚酸盐能改善机体氧自由基生成与清除之间的动态平衡，增强机体的抗氧化能力，一方面增强了脑组织清除氧自由基的能力，同时也能减轻 MDA 引起的损伤，这是其发挥缺血脑保护作用的机制之一。 丹参多酚酸盐能提升组织中 SOD 和 GSHPx 的活性的具体机制尚不清楚，但可能与其能清除体内自由基有关。有研究发现静脉应用丹参后，左半结肠癌切除术后患者血中 SOD 活性明显上升，同时自由基含量也明显减少6 。王舒平等7证实了丹酚酸能清除实验小鼠体内自由基。自由基被清除后，SOD 和 GSHPx 的消耗大大减低，从而间接提高了 SOD和 GSHPx 的活性，增强了脑组织抗自由基损伤的能力，发挥

17、脑保护作用。参考文献 1刘艾林，李铭源，王一涛，等.丹参药理学活性物质基础研究8现状J.中国药学杂志，2007，42(9):641-646. 2蒋玉凤，王秋华，刘志勤，等.丹酚酸 B 对缺血小鼠脑能量代谢和脑水肿的影响J. 中国病理生理杂志，2007，23（12）:2300-2303. 3Longa EZ， WeinsteinPR， Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in ratsJ. Stroke，1989，20(1):84-91. 4杨 涛，刘 勇，常燕群.线栓法制

18、备大鼠局灶性脑缺血模型的改进及评价J 中国临床康复，2006，10(30)：171-173. 5王晶余，许建华，徐忠信.针刺诱导脑缺血耐受与 GDNF 表达的研究J 中国实验诊断学，2008，12(12)：1580-1581. 6李德祥，陈 超，王治伟，等.丹参对梗阻性左半结肠癌一期切除术后患者自由基水平的影响J 中国普通外科杂志，2008，17(4)：400-401. 7王舒平，王艳艳，尹彩娜，等.丹酚酸 B 对高糖日粮小鼠消化系统自由基水平的影响J 天然产物研究与开发，2009，21(6)：948-951. (收稿日期：2010-09-08 修回日期：2010-12-03) (编辑：潘明志：英文审校：钟京梓) 注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以 PDF 格式阅读原文