0细菌基因组DNA提取试剂盒离心柱型.DOC

1、 10 细菌基因组 DNA 提取试剂盒（离心柱型）GK4003-10 GK4003-20GK4003-50GK4003-100一.试剂盒组成Components GK4003-1010 Preps GK4003-2020 Preps GK4003-5050 Preps GK4003-100100 PrepsgDNA Recovery Column2.0-ml Collection TubeLysis SolutionAW1 Solution(a)AW2 Solution(b)AE Buffer(c)TE(pH8.0)Boiled RNase A Proteinase K(d)Lysozyme(

2、f)SP BufferProtocolCBS Buffer10104 ml6 ml3 ml3 ml2 ml50 l30 l5 mg1.0 ml16 ml202010 ml12 ml8 ml8 ml4 ml100 l250 l15 mg1.0 ml16 ml505025 ml30 ml20 ml20 ml10 ml250 l500 l30 mg1.0 ml 115 ml10010060 ml60 ml2*24 ml40 ml20 ml500 l1000 l60 mg1.0 ml130 ml(a) 首次使用前，必须在 AW1 溶液瓶中按表示量加入无水乙醇，充分混匀后使用。每次使用后将瓶盖盖紧，以保

3、持中的 AW1 乙醇含量。如果您发现 AW1 由于运输或保管不当造成容量严重不准，请用量筒定容后再加入 0.6 倍体积的无水乙醇。(b) 首次使用前，必须在 AW2 瓶中加入 4 倍体积的无水乙醇，充分混匀后使用。每次使用后将瓶盖盖紧，以保持 AW2 中的乙醇含量。如果您发现 AW2 由于运输或保管不当造成容量严重不准，请用量筒定容后再加入 4 倍体积的无水乙醇。(d) AE Buffer 为 10 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA pH 8.5。TE(pH 8.0)或者水（pH7.0）均可以使用，但是 DNA 的洗脱效率通常要低 20%左右。(e) 收到后分装-20冻存。不得

4、将 Proteinase K 直接加到 Lysis Solution 中，以免酶失活。(f) Lysozyme 使用前加入按 5 mg 溶于 100l 计算，溶于 SP Buffer，溶解后，分装于-20 冻存。客户自备：PBS 缓冲液，胰蛋白酶，无水乙醇 运输 储存温度运输 室温储存 Proteinase K , Lysozyme , Boiled RNase A : -20其他 室温二主要用途从细菌和各种培养细胞中小规模抽提基因组 DNA。三主要特点1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，重复性好。2.不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。3

5、.快速，简捷，单个样品操作一般可在 50 分钟内完成。4.多次柱漂洗确保提取细菌基因组的高纯度， OD260/280nm 典型的比值达 1.71.9，长度可达 50100kb，可直接用于 PCR， Southern-blot 和各种酶切反应。2四培养细胞与细菌样品准备1培养细胞的准备(1) 对于悬浮培养细胞： 1,000g 室温离心 5 分钟，彻底去除上清。(2) 对于单层培养细胞：吸去培养基，用 PBS 洗涤细胞，然后用胰蛋白酶消化细胞。当细胞从培养瓶表面脱落以后，将细胞转移到离心管中，1,000g 室温离心 5 分钟，彻底去上清。(3) 将离心去上清的细胞用 200l TE(pH8.0)悬

6、浮。处理细胞可达 1106510 7 个，增加处理细胞数量，请相应增加处理时间。2细菌样品的准备(1) 将适量的指数生长期细菌（最多可达 5108 细菌，约 0.5 ml 过夜培养菌液），8,000rpm，离心 1 分钟，彻底弃净培养基。(2) 加入 200l TE(pH8.0)悬浮细菌，按照下表中的要求加入 Lysozyme 溶液，用吸头混匀，对于革兰氏阳性和革兰氏阴性菌酶解时间的要求是不一样的，详见下表。革兰氏阴、阳性菌所用溶菌酶浓度与酶解时间表溶菌酶终浓度 加入 Lysozyme 体积 室温下酶解时间革兰氏阴性菌 400g/ml 1l 或不加 35 分钟革兰氏阳性菌 3mg/ml 8l

7、/200l 悬液 510 分钟5 操作步骤柱子准备：在 gDNA Recovery Column 中加入 200l CBS 放置 2 min, 10,000rpm，室温离心 1 分钟,弃去收集管中废液， 备用。请在当天使用。1. 在按准备方法制备的 200l TE 悬浮样品中，加入 4l RNase A 混匀，再加入 4l Proteinase K，加入 200l Lysis Solution 70保温 10 分钟。注意：(1)应按次序加入，不得将 Proteinase K 先加入 Lysis Solution 再加到样品中。2. 冷却到室温，加入 200 微升无水乙醇，混匀。如有沉淀出现，用

8、 1 ml 枪头充分打匀,不影响提取。 3. 8,000rpm 室温离心 1 分钟。取下 gDNA Recovery Column，弃去收集管中的废液。4. 将 gDNA Recovery Column 回收集管中，加入 500l AW1 Solution，8 ,000rpm，室温离心 1 分钟。取下gDNA Recovery Column，弃去收集管中的废液。5. 将 gDNA Recovery Column 放回收集管中，加入 500l AW2 Solution，8 ,000rpm，室温离心 1 分钟。取下gDNA Recovery Column，弃去收集管中的废液。6. 重复步骤 5 一

9、次。7. 将 gDNA Recovery Column 放回收集管中，12,000rpm ，室温离心 1 分钟，以去除残留的 AW2 Solution。注意：此步骤高速空离是为了去尽残留的乙醇，请勿省略，否则可能因所纯化的核酸中残留有乙醇而影响后续的实验效果。8. 将 gDNA Recovery Column 放入新的洁净 的 1.5ml 离心管中，在 gDNA Recovery Column 中央加入50 100l AE Buffer，室温或 37放置 2 分钟。注意：(1)为提高洗脱效率，一般 AE Buffer 不低于 27即可，如室温较低预热到 5580。(2) 如果样品中基因组 DN

10、A 含量很低，用 30l AE Buffer 洗脱可以提高洗脱液的样品浓度，但产率有所下降。9. 12,000rpm， 室 温 离 心 1 分 钟 。 离 心 管 中 的 液 体 即 为 基 因 组 DNA。 根 据 用 途 ， 样 品 可 以 4 或 -20 保 存 。注：重复步骤 78 ，将洗脱液再次加入到吸附膜上，重新洗一次，可以提高产率 10%20%。10. 用分光光度计测量 DNA 含量按 1OD260=50g/ml 基因组 DNA 定量并标记。进行 0.7%琼脂糖凝胶电泳判定样品 DNA 的完整性和是否有 RNA。本试剂盒抽提的 DNA 长度可达 100kb 以上。六储存常温储存一

11、年。3七问答Q-1 基因组 DNA 得率低或无基因组 DNAA-1 一般情况下，从 100l-1ml 过夜培养的大肠杆菌中，可以提取 1-10g 的基因组 DNA，推荐的菌液量是用500l 的过夜培养的浓菌液。我们不建议用过多的菌液，可能导致溶液不足而降低所提 DNA 的质量。基因组DNA 得率较低时可从一下几个方面考虑：1.DNA 未充分释放，保证在 TE 中充分悬浮菌体，注意不要残留菌体，加入 Digestion Solution 充分混匀。2.溶菌酶失活，溶菌酶要用附带的 SP buffer 配制，用水或碱性的 TE 配置的溶菌酶不能长期保存。配制好的溶菌酶最好分装成小份于-20保存。3

12、.Proteinase K 失 活 ， proteinase K 起 到 酶 解 细 菌 的 作 用 ， 该 酶 失 活 后 细 菌 裂 解 效 率 将 大 大 降 低 。4.洗脱时将灭菌水或 Elution Buffer 加热至 65后使用将有利于提高洗脱效率。5.严格按照操作方法进行操作有利于提高基因组 DNA 得率。Q-2 提取的基因组 DNA 有降解，为什么？A-2 1.确认选用的培养菌体是否新鲜，如果菌体需要保存时，请于-80保存2.起始菌液量过多，导致菌液裂解不充分，部分 DNA 降解。3.菌 体 本 身 富 含 DNA 酶 活 性 ， 加 入 Digestion solution

13、 后 再 补 加 20ul 0.5M EDTA 溶 液 来 抑 制 内 源 性 核 酸 酶 。Q-3 提取的 DNA 中有 RNA 污染，为什么？A-3 1.一般提取基因组 DNA 过程中，RNA 残留已经很少了，如果需要减少提取 DNA 中的 RNA 的含量，有必要在消化步骤中加入 4l RNase A。2. RNase A 可能失活。 RNase A 一般比较稳定，不易失活。如果确认是 RNase A 长期保存等原因导致其活性丧失，可以用实验室中已有的 RNase A 替代试剂盒中的 RNase A。Q-4 提取的基因组 DNA 生物活性差，为什么？A-4 1. 提取的基因组 DNA 中盐

14、分浓度过高，请严格按照说明书操作。2. 提取的基因组 DNA 中含有乙醇。离心的速度和时间应该严格遵循说明书要求进行。Q-5 能否用本试剂盒提取酵母中的基因组 DNA？A-5 不 能 ， 酵 母 属 于 真 核 生 物 ， 其 细 胞 壁 的 化 学 组 成 和 结 构 与 细 菌 不 同 ， 因 此 Lysozyme 不 能 使 其 细 胞 壁 溶 解 ， 所以 ， 本 试 剂 盒 不 能 提 取 酵 母 中 的 基 因 组 DNA。 如 果 需 要 提 取 酵 母 基 因 组 DNA， 请 用 酵 母 提 取 试 剂 盒 。Q-6 本试剂盒是否适用于任何菌体基因组 DNA 的提取？A-6 不一定。有些细菌的细胞壁的结构比较特殊，使用 Lysozyme 进行溶菌，其基因组 DNA 不能有效的释放出来。比如 Staphylococcus Aureus 等革兰氏阳性菌便无法使用本试剂盒提取基因组 DNA。Product Use Limitation:This product is developed, designed and sold exclusively for research purpose and in vitro use only.