SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳.doc

1、聚丙烯酰氨凝胶电泳作用原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，它有两种形式，一种是非变性聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质在电泳中保持完整的状态，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。 而 SDS-PAGE 仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。这个技术首先是1967 年由 shapiro 建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。 SDS 是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨

2、酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和 SDS 后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和 SDS 结合成蛋白- SDS 胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的蛋白量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。 SDS-PAGE 一般采用的是不连续缓冲系统，于连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。 浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选 TRIS/HCL 缓冲液，电极液选 TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCL 解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此

3、一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 采用十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE，polyacrylamide gel electrophoresis）方法可对蛋白质的组分进行分离，并可精确测得蛋白质的分子量。常用的方法为 SDS-PAGE 不连续系统。基本原理：聚丙稀酰胺是由丙稀酰胺（acrylamide）和 N,N-亚甲基

4、双丙稀酰胺（N,N-methylene bis acrylamide）经共聚合而成。此聚合过程是由四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）和过硫酸胺（ammonium persulfate，AP）激发的。被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙稀酰胺，使多聚链交叉互连成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。丙烯酰胺是一种白色晶体化学物质，是生产聚丙烯酰胺的原料。聚丙烯酰胺主要用于水的净化处理、纸浆的加工及管道的内涂层等。淀粉类食品在高温（ 120）烹调下容易产生丙烯酰胺。研究表明，人体可通过消化道、呼吸道、皮

5、肤黏膜等多种途径接触丙烯酰胺，饮水是其中的一条重要接触途径。丙烯酰胺进入体内又可通过多种途径被人体吸收，其中经消化道吸收最快。进入人体内的丙烯酰胺约 90被代谢，仅少量以原形经尿液排出。丙烯酰胺进入体内后，会在体内与 DNA 上的鸟嘌呤结合形成加合物，导致遗传物质损伤和基因突变。对接触丙烯酰胺的职业人群和偶然暴露于丙烯酰胺人群的调查表明，丙烯酰胺具有神经毒性作用，但目前还没有充足的证据表明通过食物摄入丙烯酰胺与人类某种肿瘤的发生有明显关系。丙烯酰胺简介丙烯酰胺是一种有机化合物，别名 AM；纯品为白色结晶固体，易溶于水、甲醇、乙醇、丙醇，稍溶于乙酸乙酯、氯仿，微溶于苯，在酸碱环境中可水解成丙烯酸

6、。职业性接触主要见于丙烯酰胺生产和树脂、黏合剂等的合成，在地下建筑、改良土壤、油漆、造纸及服装加工等行业也有接触机会。日常生活中，丙烯酰胺可见于吸烟、经高温加工处理的淀粉食品及饮用水中。 N.N-亚甲基双丙烯酰胺，别名 MBA，双叫 N.N-甲叉双丙烯酰胺，次甲基双丙烯酰胺，N.N-甲撑双丙烯酰胺。是一种白色晶体粉末，无味，吸湿性极小。遇高温或强光则自交联，微溶于水、乙醇。 丙烯酰胺单体和交联剂 N1 N-亚甲基双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合成含有酰胺基侧链的脂肪族长链。相邻的两个链通过亚甲基桥交联起来就形成三维网状结构的聚丙烯酰胺凝胶。 N, N -亚甲基双丙烯酰胺又名甲撑双丙烯酰胺 , 英

7、文缩写名 MBA, 为白色或浅黄色粉末状结晶 , 毒性低 , 对皮肤无刺激 , 无神经毒性 , 溶于水及乙醇、丙酮等有机溶剂。在它的结构中具有两个相同且非常活泼的反应性官能团 , 可作为交联剂 ,能将线性高分子迅速转变为体型高分子 , 制备吸水性聚合物 , 还可与各种离子型单体发生聚合反应 ,使其在石油开采以及医药、水处理等行业具有广泛用途。 产品简介： TEMED 即 N,N,N,N-Tetramethylethylenediamine，中文名为N,N,N,N-四甲基二乙胺。分子式为(CH3)2NCH2CH2N(CH3)2， 分子量为116.20。 进口分装，用于配制 PAGE 胶等。TEM

8、ED 通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。加入加速剂 TEMED 后聚合马上开始，应立即将凝胶混匀，迅速灌胶。保存条件： 4保存。 注意事项： 易燃，有腐蚀性，请注意防护。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 过硫酸铵 分子式: (NH4)2S2O8 分子量: 228.20性状：过硫酸铵是一种白色、无味晶体，常作强氧化剂使用，也可用作单体聚合引发剂。它几乎不吸潮，由于能达到很高的纯度而具有特别好的稳定性，便于储存。另外，它还具有使用方便、安全等优点。储存及使用注意事项：过硫酸铵属于非易燃品，但由于能释放氧而有助燃作用，因此必须在一定条件下储存。首先必须存

9、放在干燥、密闭的容器中，其次应避免阳光直射、热源、潮湿等不利因素。另外，一些杂质如脏物、铁锈、少量金属以及还原剂可能引起过硫酸铵的分解，在存放和使用过程中也必须注意。由于潮湿的过硫酸铵粉末及其水溶液有漂白和轻微的腐蚀作用，因此使用过程中应避免眼睛、皮肤和衣物直接与其接触。 过硫酸铵的应用：过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。须新鲜配制。过硫酸铵是乳胶或丙烯酸单体聚合液、醋酸乙烯、氯乙烯等产品的引发剂，同时也是苯乙烯、丙烯腈、丁二烯等胶体发生共聚作用的引发剂。 过硫酸铵-TEMED（四甲基乙二胺）系统 ：在 Acr 和 Bis 的溶液中放入这个催化系统后，过硫酸铵（NH4）2

10、S2O8产生出游离氧原子使单体成为具有游离基的状态，从而发生聚合作用。聚合的初速度和过硫酸铵浓度的平方根成正比。这种催化系统需要在碱性条件下进行。例如，在 pH 8.8 条件下 7的丙烯酰胺溶液 30 分钟就能聚合完毕；在 pH 4.3 时聚合很慢，要 90 分钟才能完成。温度与聚合的快慢成正比。通常在室温下就很快聚合，温度升高聚合更快。如将混合后的凝胶溶液放在近 0的地方，就能延缓聚合。一般来讲，温度过低，有氧分子或不纯物质存在时都能延缓凝胶的聚合。为了防止溶液中气泡含有氧分子而妨碍聚合，在聚合前须将溶液分别抽气，然后再混合。十二烷基硫酸钠 SDS 不连续系统由上层浓缩胶和下层的分离胶组成。

11、浓缩胶（pH6.7，孔径大）主要作用是使样品浓缩，使样品在未进入分离胶前，被浓缩成很窄的条带，从而提高分离效果。分离胶（pH8.9，孔径小）通过分子筛效应和电荷效应，把样品中的各组分按分子量和电荷的大小而分开。 如果要利用凝胶电泳测定某一蛋白质的分子量就必须将电荷效应去掉或减少到可以忽略不计的程度，使蛋白质泳动率的大小完全取决于分子量。如何去除电荷效应呢？现常用的是十二烷基硫酸钠（SDS）。SDS 是一种阴离子去污剂。在电泳体系中加入一定浓度的SDS，SDS 以一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质分子带负电荷，这种负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷，从而减低或消除了各种蛋白质分子天然

12、电荷的差异。 SDS 是阴离子型表面活性剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，再与 PAGE 技术结合，则谱带差异更加明显、清晰，并可测定蛋白质分子量。 SDS-PAGE 只是按照分子大小分离的，而不是根据分子所带的电荷和大小分离的。 SDS 带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用 Mr 差异将各种蛋白质分开。甘氨酸最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由 Ornstein(1964) 和 Davis(1964) 设计的, 样品和浓缩胶中含 Tris-HC

13、l(pH 6.8), 上下槽缓冲液含 Tris-甘氨酸(pH 8.3), 分离胶中含 Tris-HCl(pH 8.8)。系统中所有组分都含有 0.1% 的 SDS(Laemmli, 1970)。样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域, 它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。此处 pH 值较高，有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS-蛋白质复合物成一电位和 pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。 浓缩效

14、应：凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶，下层为分离胶。浓缩胶为大孔胶，缓冲液 pH6.7，分离胶为小孔胶，缓冲液 pH8.9。在上下电泳槽内充以 Tris甘氨酸缓冲液(pH8.3)，这样便形成了凝胶孔径和缓冲液 pH 值的不连续性。在浓缩胶中 HCl 几乎全部解离为 Cl-，但只有极少部分甘氨酸解离为 H2NCH2COO-。蛋白质的等电点一般在 pH5 左右，在此条件下其解离度在HCl 和甘氨酸之间。当电泳系统通电后，这 3 种离子同向阳极移动。其有效泳动率依次为 Cl-蛋白质H2NCH2COO-，故 C1-称为快离子，而 Gly- 称为慢离子。电泳开始后，快离子在前，在它后面形成离子浓

15、度低的区域即低电导区。电导与电压梯度成反比，所以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和慢离子之间形成个稳定而不断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间，因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩成条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理:不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳包含了两种以上的缓冲液成分、pH 值和凝胶孔径，而且在电泳过程中形成的电位梯度亦不均匀。由此产生的浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。1浓缩效应 样品在电泳开始时，通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层(一般能浓缩几百倍)，然后再被分离。当

16、通电后，在样品胶和浓缩胶中，解离度最大的 Cl有效迁移率最大，被称为快离子，解离度次之的蛋白质则尾随其后，解离度最小的甘氨酸离子(PI=60)泳动速度最慢，被称为慢离子。由于快离子的迅速移动，在其后边形成了低离子浓度区域，即低电导区。电导与电势梯度成反比，因而可产生较高的电势梯度。这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。因而在高电势梯度和低电势梯度之间形成一个迅速移动的界面，由于样品中蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，所以，也就聚集在这个移动的界面附近，逐渐被浓缩，在到达小孔径的分离胶时，已形成一薄层。2电荷效应 当各种离子进入 pH89 的小孔径分离胶后，甘氨酸离子的电泳

17、迁移率很快超过蛋白质，高电势梯度也随之消失，在均一电势梯度和 pH 的分离胶中，由于各种蛋白质的等电点不同，所带电荷量不同，在电场中所受引力亦不同，经过一定时间电泳，各种蛋白质就以一定顺序排列成一条条蛋白质区带。3分子筛效应 由于分离胶的孔径较小，分子量大小或分子形状不同的蛋白质通过分离胶时，所受阻滞的程度不同，因而；迁移率不同而被分离。此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，受阻滞的程度不同，小分子走在前面，大分子走在后面，各种蛋白质按分子大小顺序排列成相应的区带。毒性丙烯酰胺属中等毒类，对眼睛和皮肤有一定的刺激作用，可经皮肤、呼吸道和消化道吸收，在体内有蓄积作用，主要影响神经系统，急性

18、中毒十分罕见。密切大量接触可出现亚急性中毒，中毒者表现为嗜睡、小脑功能障碍以及感觉运动型多发性周围神经病。长期低浓度接触可引起慢性中毒，中毒者出现头痛、头晕、疲劳、嗜睡、手指刺痛、麻木感，还可伴有两手掌发红、脱屑，手掌、足心多汗，进一步发展可出现四肢无力、肌肉疼痛以及小脑功能障碍等。丙烯酰胺慢性毒性作用最引人关注的是它的致癌性。丙烯酰胺具有致突变作用，可引起哺乳动物体细胞和生殖细胞的基因突变和染色体异常。动物试验研究发现，丙烯酰胺可致大鼠多种器官肿瘤，如乳腺、甲状腺、睾丸、肾上腺、中枢神经、口腔、子宫、脑下垂体肿瘤等。但目前还没有充足的人群流行病学证据表明，食物摄入丙烯酰胺与人类某种肿瘤的发生有明显相关性。国际癌症研究机构（IARC）对其致癌性进行了评价，将丙烯酰胺列为 2 类致癌物（2A），即人类可能致癌物。其主要依据为，丙烯酰胺在动物和人体均可代谢转化为致癌活性代谢产物环氧丙酰胺。