免疫多聚酶链反应.doc

1、免疫多聚酶链反应一、 原理免疫多聚酶链反应(PCR)是一种抗原检测系统，将一段已知序列的 DNA 片段标记到抗原抗体复合物上，再用 PCR 方法将这段 DNA 扩增，然后用常规方法检测 PCR 产物。由于 PCR 具有强大的扩增能力，因而比常规的免疫学检测法，如 ELISA 和放射免疫测定(RIA)的敏感性提高好几个数量级。免疫 PCR 的原理与 ELISA 和 RIA 等常规免疫学检测方法基本相同，只不过是用 DNA 片段代替了酶或放射性核素作为标记物。通常需要一个对抗体和 DNA 具有双亲和力的连接物，将 DNA 与抗体偶联在一起。抗体与抗原结合后，用该 DNA 片段特异的一对引物做 PC

2、R，分析扩增产物。特异性 PCR产物的存在表明有该 DNA 片段标记的抗体所针对的特异性抗原存在。将 DNA 标记到抗体分子上的方法有多种，一种是通过链亲和素(streptavidin) 蛋白A(protein A)的融合蛋白，它具有两种独立的结合功能，链亲和素结合生物素(biotin)，蛋白 A 结合免疫球蛋白 G 的 Fc 片段，从而使生物素标记的 DNA 片段连接到 IgG 分子上。另一种方法是用单特异性的多价结合分子，如亲和素(avidin)或链亲和素，它们是四价分子，即一个分子可与四个生物素分子结合，因而可以将生物素标记的 DNA 片段与生物素标记的抗体分子结合到一起。二、 材料、方

3、法和结果免疫 PCR 可以在 96 孔塑料板(ELISA 板)或微量离心管(05ml) 中进行。(一) 生物素标记特异性抗体免疫球蛋白(如 IgM、IgG)的 Fc 片段上有糖基存在，因而可用能与糖基结合的 BiotinLChydrazide 作生物素标记。1 将纯化的抗体(IgM 或 IgG，011mg/ml) 在标记缓冲液(01mol/L NaAc,pH 值55 ，01mol/L NaCl)中 4透析过夜。2 吸取 05ml 至微量离心管中，加过碘酸钠溶液至终浓度 10mmol/L，置冰浴上于暗处孵育 30min，使抗体分子上的糖基氧化。3 将氧化的抗体过 PBS 平衡的 Sephadex

4、 G25 PD10 预装柱(Pharmacia)，使之与过碘酸钠分开。收集蛋白峰。4 向抗体管中加入 biotinLChydrazide(Pierce) 至终浓度 5mmol/L，置混摇器上室温孵育 1h。5 用含 002% NaN 的 PBS 平衡 Sephadex G25 预装柱，将生物素标记的抗体分子过柱与游离的生物素分开。收集蛋白峰，保存在-20。(二) 生物素标记 DNA 片段作为将与抗体偶联的报告 DNA 片段，应确保在待测抗原来源的机体 DNA 中无同源序列，如可选用大肠杆菌的序列作为报告 DNA 去检测人源的标本。DNA 片段大小为 300500bp，生物素标记可采用 PCR

5、方法，根据报告 DNA 的核苷酸序列合成一对引物，其中一个引物的 5端碱基上带有生物素标记。1 在 05ml PCR 管中将下列试剂混合：HJ*2试剂添加量终浓度10 PCR 缓冲液 10l1BHDW25mmol/L 4dNTP 混合物 8l02mmol/LBH50mol/L 生物素标记的上游引物 1l05mol/LBH50mol/L 下游引物 1l05mol/LBH15mmol/L MgCl 1l15mmol/LBH模板 DNA1l1gBHTaq DNA 聚合酶 1l5UBH加 H O 至 100lHJ1HJ2 混匀后上面覆盖液体石蜡。3 95加热 5min，然后在 PCR 仪上按下列程序扩

6、增： 94 1min；55 1min；72 1min；40 个循环。最后 72延伸 10min。4 加等量酚 氯仿抽提，然后加 10l 3mol/L KAc,250l 无水乙醇，置-70 30min。5 离心沉淀 DNA 片段，用 70%乙醇洗一次。6 将沉淀干燥后重溶于 TE 缓冲液，保存在-20。(三) 制备抗体 亲和素DNA 复合物将生物素标记的抗体与亲和素按等分子浓度混合于含有 1mg/ml BSA 的 PBS 中，室温孵育 30min，再加入两倍分子浓度的生物素标记的 DNA 片段，继续孵育 30min，最后加入 10 倍分子浓度的生物素，将亲和素分子上的结合部位饱和。最后过凝胶过滤

7、柱将复合物与未结合的单体分开，加 BSA 达 1mg/ml，分装后冻存于-20。(四) 免疫 PCR1 按常规 ELISA 方法，用包被缓冲液稀释抗原，加到 96 孔塑料板或 05ml PCR 管中，4过夜。2 用 PBS 洗三次，然后每孔加 200l 封闭液(PBS 含 10mg/ml BSA,1mg/ml 鱼精 DNA)，室温孵育3min。3 用 TETBS(其配方：20mmol/L TrisHCl pH 值 74 ，015mol/L NaCl,01% Tween 20,01mmol/L EDTA,002% NaN )洗三次。4 将抗体 亲和素DNA 复合物稀释于含有 1mg/ml BSA

8、 和 01mg/ml 鱼精 DNA 的 TETBS中，每孔加 50l，室温孵育 1h。5 用 TETBS 洗 5 次，然后将塑料板或管倒置在吸水纸上拍打以控干水分。6 每管中加 50l PCR 反应液，含有下列成分：HJ*2试剂添加量终浓度10 PCR 缓冲液 5l12.5mmol/L4dNTP 混合物 4l0.2mmol/L50mol/L 上游引物 0.5l0.5mol/L50mol/L 下游引物 0.5l0.5mol/L15mmol/LMgCl 5l1.5mmol/LTaq DNA 聚合酶 0.5l2.5U加 H O 至 50lHJ1HJ7 混匀后，上面覆盖液体石蜡。8 95加热 5min

9、，然后在 PCR 仪上按下列程序扩增 35 个循环：94 1min，55 1min，72 1min。最后 72延伸 10min。9 每管取 5l 作琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴化乙锭染色后观察结果，如在 PCR 时加入了放射性核素标记，则可用 X 光片显影。亦可在凝胶电泳后做 southernblot ，用特异性探针杂交，进一步提高其特异性和 敏感性 。三、 注 意 事 项本实验的关键步骤是获得适当的抗体DNA 复合物。用链亲和素将生物素标记的抗体与生物素标记的 DNA 偶联的方法，因每个链亲和素分子可与四个生物素分子结合，因此要优化反应条件，以使得每个链亲和素分子既能结合上抗体分子，又能结

10、合上 DNA 片段。此外还可用化学方法将 DNA 片段与抗体分子共价偶联，即将抗体分子和 5端氨基修饰的DNA片段分别用不同的双功能偶联剂激活，然后通过自发的反应偶联到一起，比如，用NSuccinimidylSacetyl thioacetate(SATA)活化氨基修饰的 DNA 片段，用SulfoSuccinimidyl 4(maleimidomethyl) Cyclohexane1Carboxylate(SulfoSMCC) 修饰抗体分子，然后将二者在一小管中混合，通过加入盐酸胲(Hydroxylamine hydrochloride)使二者偶联在一起。免疫 PCR 具有高度敏感性。因此，

11、抗体和标记 DNA 的任何非特异性结合均会导致严重的本底问题。因而在加入抗体和标记 DNA 后必须尽可能彻底地清洗。即使有些特异性结合的抗体或标记 DNA 被洗掉了，亦可在最后通过增加 PCR 的循环次数得到弥补。此外，应用有效的封闭剂对防止非特异性结合也是非常重要的。可用脱脂奶粉和牛血清白蛋白做蛋白封闭剂，用鱼精DNA 做核酸封闭剂。防止本底信号的另一个重要因素是控制污染，这也是所有敏感的检测系统存在的问题。即使每一步试验都做得非常认真，重复使用同样的引物和标记 DNA 均会产生假阳性信号。免疫 PCR 的一个主要优点是标记 DNA 序列完全是人为选定。因此标记 DNA 及其引物可经常变换，

12、以避免由于污染造成的假阳性信号。免疫 PCR 可以检测到常规免疫学方法无法检测的样品。因此，应用免疫 PCR 可在微观水平(单细胞)检测到抗原，定量 PCR 产物可以估计某一标本中的抗原数量，在临床诊断中可在疾病早期抗原量很低时检测到微量的抗原。附PCRELISA一、原理PCRELISA 是用免疫学方法检测 PCR 产物，这比常规用电泳方法及 Southernblot 要简便、省时，可同时处理大量标本，便于自动化。PCRELISA 的原理是在做 PCR 扩增时应用生物素(biotin)标记的引物，这样 PCR 的产物就可结合到亲和素(avidin)包被的塑料板上，再用地高辛标记的探针与 PCR

13、 产物杂交，然后就可以用抗地高辛的酶联反应检测。二、材料、方法和结果1PCR 扩增按基本 PCR 技术做 DNA 扩增，只是所用的引物至少有一个是 5端用生物素标记的。通常可在 DNA 合成仪上直接合成 5端带生物素标记的引物。2 地高辛标记的探针杂交将地高辛标记的 DNA 探针 01g 稀释于 90l 50mmol/L TrisHCl,pH 值 83,80mmol/L KCl 中。取 10l PCR 产物加到管中，加热至 90，缓慢冷却至67。离心 1s，置 52水浴保温 1h。3 将杂交产物固定到塑料板上可用商品供应的亲和素包被的酶标板，亦可用普通酶标板按常规方法将亲和素包被上；每孔加 1

14、00l 封闭液(含 10mg/ml BSA,1mg/ml 鱼精 DNA的 PBS)，室温 1h；PBST 洗 3 次；将地高辛探针杂交的 PCR 产物直接加到酶标板上，室温孵育 1h；PBST 洗 3 次。4ELISA 检测将抗地高辛抗体稀释于 PBS 中，每孔加 100l，室温孵育 1h；PBST洗3 次；将酶标的第二抗体稀释于 PBS 中，每孔加 100l，室温孵育 1h；PBST 洗 3 次；每孔加 100l 酶底物，在颜色适合后终止反应；在酶标仪上读结果。三、注意事项本法的敏感性可与放射性同位素标记相比，但又避免了同位素的危险。做大量样品时，应统一配制反应液，再小心地分装到各反应管中，

15、以免污染，并使各管条件一致。非特异性反应常由于地高辛标记的 DNA 探针与酶标板直接结合所致，因此在封闭液中一定要包括足量的鱼精 DNA。相关帮助需要相关抗体试剂的可以访问 Fantibody 全球抗体搜索引擎fantibody 全球抗体搜索引擎是一个供公共检索的抗体数据库，其抗体信息数据来源于全球范围的研究机构与商业公司。该引擎由商品化抗体数据库与抗体应用评价数据库两部分组成，以帮助研究者更高效的寻找并评估该抗体的性能。全球抗体搜索引擎是继基因与蛋白数据库之后更为复杂的应用型检索平台，网址：http:/需要相关的实验室仪器设备、生物试剂、医疗器械、制药设备、医药原料、体外诊断试剂及耗材与技术服务信息的，可以访问探生网进行咨询，期待您的加入：http:/