NY-ESO-1b多肽诱导的抗肝癌免疫及FOXP3在肝癌发生发展中的作用和机制研究.doc

1、 博士研究生学位论文 论文题目： NY-ESO-1b多肽诱导的抗肝癌免疫及 FOXP3 在肝癌发生发展中的作用和机制研究 姓 名： 陈衍辉 学 号： 1111110225 院 （部）： 北京大学人民医院 专 业： 内科学（传染病） 导 师： 陈红松 研究员 副 导 师： 郭 远 副主任医师 完成时间：二 O 一四 年 四 月 博士研究生学位 论文 NY-ESO-1b 多肽诱导的抗肝癌免疫及 FOXP3 在肝癌发生 发展中的作用和机制研究 NY-ESO-1b peptide induced anti-hepatoma immunity and the role of FOXP3 in the p

2、athogenesis of hepatocellular carcinoma “十一五”科技重大专项（ NO. 2008ZX10002-019） “十二五”科技重大专项 （ No.2012ZX10002011-006） 国家自然科学基金（ No. 91029741; No. 81001072） 北京市自然科学基金（ No. 5112032） 研究生： 陈衍辉 导 师： 陈红松 研究员 副 导师： 郭 远 副主任医师 北京大学人民医院 北京大学肝病研究所 完成时间：二 O 一四 年 四 月 姓名： 陈衍辉 院系： 北京大学人民医院 学号： 1111110225 北京大学医学部学位论文原创性声明

3、和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任 何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文使用授权说明 （必须装订在提交学校图书馆的印刷本） 本人完全了解北京大学医学部关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化

4、或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容； 学校可以为存在馆际合作关系的兄弟高校用户提供文献传递服务和交换服务。 请选择图书馆发布时间 : 即时发布 一年发布 二年发布 （保密论文在解密后遵守以上规定） 论文作者签名： 导师签名： 日期： 年 月 日 目 录 中文摘要 1 英文摘要 6 文献综述 肝癌免疫治疗的研究现状及进展 11 引 言 29 第一部分 应用 NY-ESO-1b多肽疫苗进行肝癌免疫治疗的特殊 I期临床研究 31 前言 31 材料和方法 32 结 果 47 讨 论 51 第 二 部分 肝癌细胞表达 FOXP3在肝癌发生发展中的作用和机

5、制研究 55 前 言 55 材料与方法 56 结 果 65 讨 论 77 第 三 部分 FOXP3基因多态性与乙型肝炎相关肝细胞癌的相关性研究 79 前 言 79 材料与方法 79 结 果 83 讨 论 89 结 论 91 参考文献 92 附 录 110 个人简历 113 致 谢 117 北京大学 2014 届博士研究生毕业论文 中文摘要 1 中 文 摘 要 NY-ESO-1b 多肽诱导的抗肝癌免疫及 FOXP3 在肝癌 发生发展中的作用和机制研究 研究生： 陈衍辉 导 师： 陈红松 ；副导师：郭远 北京大学人民医院，北京大学肝病研究所 ；内科学（传染病） 研究背景： 原发性肝癌（以下简称肝癌

6、）是一种恶性度高、治愈率低、预后差的常见恶性肿瘤 。 手术切除是目前 肝癌 主要的治疗手段，但手术 后的 高转移率和高复发率限制了肝癌治疗的远期疗效。因此， 近年来已经有研究者开始尝试对肝癌进行免疫治 疗 。 目前 ，已在肝癌 中鉴定出了 多个肿瘤 相关抗原（ tumor-associated antigen， TAA），可以制成多肽疫苗进行肝癌免疫治疗 1-2。文献报道 ， 食管鳞状细胞癌抗原 -1（ new york-esophageal-1， NY-ESO-1） 是具有高度免疫原性的 TAA3，其 基因 家族 中的 L 抗原基因 -1（ L antigen gene-1， LAGE-1）

7、与 NY-ESO-1 的氨基酸序列高度同源。 理论上 ， NY-ESO-1/LAGE-1 表达 阳性的肿瘤可以被 NY-ESO-1源性 多肽 疫苗 诱导的特异性 T细胞 靶向 杀伤 。 到 目前为止，尚未有关于应用 NY-ESO-1 多肽疫苗治疗肝癌的文献报道。 研究者发现 ， 肿瘤诱导的免疫抑制是负向调节肿瘤免疫应答的重要因素。 提高肿瘤免疫治疗的 有效 应答率， 需要 尽可能 地去除免疫微环境中的抑制因素。FOXP3 表达阳性的 调节性 T 细胞（ regulatory T cell， Treg）是肿瘤微环境中经典的免疫抑制因素。 然而 除 Treg 细胞外 ，多种肿瘤细胞也可以表达 FO

8、XP3。有研究 提示 FOXP3 基因 可能通过非 Treg细胞 依赖的其他机制来影响肿瘤 免疫 微环境4。我们的前期研究发现 ， FOXP3 在肝癌组织和肝癌细胞 株中高表达， 其作用和机制 需要 进一步研究 。此外， 单核苷酸多态性（ single nucleotide polymorphism，SNP） 是人基因组内最为广泛的遗传变异，它可能跟基因的差异性转录有关，进而影响基因的功能。 因此， FOXP3 基因的 SNP 与肝癌是否有关 值得研究 。 北京大学 2014 届博士研究生毕业论文 中文摘要 2 本研究将以肝癌为研究对象，进行以下三个方面的研究： 一、 开展基于NY-ESO-1

9、 多肽的肝癌治疗性疫苗的 特殊 I 期临床试验， 对 人类主要组织相容性抗原 -A2（ human leukocyte antigen-A2， HLA-A2） 限制性 NY-ESO-1 多 肽（ NY-ESO-1b， 157-165 位， SLLMWITQC）辅以佐剂 Montanide ISA-51VG 并联合全身性的 粒细胞 /巨噬细胞 -集落刺激因子（ granulocyte macrophage colony stimulating factor， GM-CSF）的疫苗制剂治疗 表达 NY-ESO-1/LAGE-1 的肝癌患者 的安全性和免疫效能进行评价； 二、 明确 FOXP3 基因

10、在肝癌中的表达情况，并探讨其在肝癌发生和发展中的作用和机制； 三、 分析 FOXP3 基因多态性与肝癌的关系。 第一部分 应用 NY-ESO-1b 多肽疫苗进行肝癌免疫治疗的特殊 I 期临床研究 研究目的： 本 研究将对 HLA-A2 限制性 NY-ESO-1多 肽（ NY-ESO-1b， 157-165位， SLLMWITQC）辅以佐剂 Montanide ISA-51VG 并联合全身性 的 GM-CSF的疫苗制剂治疗肝癌患者的安全性和免疫治疗效能进行评价。 材料和 方法： 本研究为特殊 I 期 临床试验 ， 共入组肝癌患者 20 例，随机分入 A 组（实验组）和 B 组（ 对照 组）， 各

11、 10 例。 A 组的疫苗组分为NY-ESO-1b/Montanide ISA-51VG， B 组的疫苗组分为 生理盐水 /Montanide ISA-51VG。疫苗 的 注射 计划 ： 周期 1（ 每周 接种 1 次 ； 连续 4 周 后 ，休息 2 周 ）+周期 2（ 重复 周期 1） 。 GM-CSF 的注射 计划： 周期 1（ 每 天接种 1 次 ，连续 6天后歇 1 天； 连续 4 周 后 ，休息 2 周 ） +周期 2（重复周期 1）。 疫苗注射期间 进行 疫苗 安全性 评估 。第 4 周和第 10 周 对 患者进行迟发 型 超敏反应（ delayed type hypersens

12、itivity， DTH）测试。 第 0 周、 5 周 、 11 周 、 20 周 、 28 周 、 40 周 和 52周 ， 通过 酶联免疫斑点试验（ enzyme linked immunospot assay， ELISPOT）检测肝癌患者 外周血 中 NY-ESO-1 特异性 CD8+ T 细胞 的 IFN-分泌 情况；通过 MHC-肽五聚体（ pentamer）法检测 NY-ESO-1 特异性 CD8+ T 细胞 的数量。第 0 周、 6周 和 12 周对 患者的 疾病状态进行 评估 。 结果： 疫苗安全性评价结果显示： 1 例（ 5%）患者出现疲劳， 17 例（ 85%）患者出现瘙痒， 5 例（ 25%）患者出现皮疹。在 A 组中， NY-ESO-1 阳性的肝癌