WesternBlot(免疫印迹法).doc

1、Western Blot(免疫印迹法)主要包括以下 4 个基本步骤： 样品制备 电泳分离 蛋白的膜转移 免疫杂交与显色蛋白检测溶液和试剂 1X 磷酸盐缓冲液(PBS) Modified RIPA buffer Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;PMSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM 1X SDS 样品缓冲液62.5 m

2、M Tris-HCl (pH 6.8 于 25C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝 转移缓冲液25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸 , 20%甲醇 (pH 8.3) 10X Tris缓冲盐 (TBS)准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为 7.6 脱脂奶粉或BSA 甲醇 TBS/T缓冲液1X TBS, 0.1% Tween-20 封闭缓冲液（TBS/T）1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA 一抗的稀释1X TBS, 0.1

3、% Tween-20 加 5% BSA (多抗)或 5%脱脂奶粉(单抗)Note: 一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。 预染的蛋白质Marker ，可用于监测转膜的效率样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或 亲 和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。1 培养细胞或药物处理。2 弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。3 加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate, 100 l /w或 75 cm2 plate,

4、 500-1000 l/瓶)，刮落细胞，转移到 Ep管。 注意：冰上操作。4 超声 1015秒剪切DNA 以减低样品粘性。5 煮沸样品5 minutes。6 离心12000g, 5 min，取上清。7 电泳分离：上样15l20 l 至 SDS-PAGE 胶 (10 cm x 10 cm)电泳。如要定量检测某蛋白的表达水平，应用RIPA 裂解液 (1 ml per 107 cells/100 mm dish/150 cm2 flask)裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振 荡器上混匀415min，14000g离心15min（4），弃沉淀，用Bradford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度

5、以调整上样体积和上样量，进行Western杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actin。注意：一般上样2030 g已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100g ，但 电 泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。电泳分离（参照SDS-PAGE电泳方法）转膜杂交膜的选择是决定 Western blot 成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot 的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC) 和 PVDF 膜。NC 膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电

6、荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结 合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的 NC 膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用 0.45m 和 0.2m 两种规格的 NC 膜。大于 20kD 的蛋白可用 0.45m 的膜，小于 20kD 的蛋白就要用 0.2m 的膜了，如用 0.45m 的膜就会发生“Blowthrough”的现象。PVDF 膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但 PVDF 膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和 1-5 秒钟。蛋白质常用的转移方

7、法主要有两种：槽式湿转和半干转移。前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。以下为槽式湿转的操作步骤。1. 将胶浸于转移缓冲液中平衡 10min。注意：如检测小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易扩散出胶。2. 依据胶的大小剪取膜和滤纸 6 片，放入转移缓冲液中平衡 10min。如用PVDF 膜需用纯甲醇浸泡饱和 3-5 秒钟。3. 装配转移三明治：海绵3 层滤纸 胶膜3 层滤纸 海绵，每层放好后，用试管赶去气泡。切记：胶放于负极面（黑色面）。4. 将转移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面对黑色面），加转移缓冲液，插上电极，100V ，1h（电流约为 0.3A）。注意

8、：应再次检查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通。5. 转膜结束后，切断电源，取出杂交膜white (+) black (-)spongespongewhatmanwhatmangelfilter免疫杂交与显色1用25 ml TBS 洗膜5min，室温，摇动。2置膜于25 ml 封闭缓冲液中1h, 室温，摇动。3 15ml TBS/T洗3次（5 min/T）。4加入合适稀释度的一抗，室温孵育1-2h或4C 过夜，缓慢摇动。5 15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。6加入合适稀释度的碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗，室温孵育1h，缓慢摇动。7 15 ml TBS/

9、T洗3次（5 min/T）。8 15 ml TBS洗1次。9蛋白检测(显色法或发光法，按相应试剂说明操作)。注意事项：1 操作中戴手套，不要用手触膜。2 PVDF膜在甲醇中浸泡时间不要超过5秒。3 如检测小于20kD的蛋白应用0.2m的膜，并可省略转移时的平衡步骤。4 某些抗原和抗体可被Tween-20 洗脱，此 时可用1.0% BSA代替Tween-20。5 关于封闭剂的选择：5%脱脂奶/TBS or PBS: 能和某些抗原相互作用，掩盖抗体结合能力；0.33% BSA in PBS：低的内源性交叉反应性。6 如用0. 1% Tween 20、 0.02% NaN3 in PBS or TB

10、S作封闭剂和抗体稀释液，抗体检测后可进行蛋白染色。7 如要同时检测大分子量和小分子蛋白，最好用梯度胶分离蛋白。PVDF 膜上蛋白的可逆染色Western 杂交时， 为确认蛋白是否转至 PVDF 膜上，可用下列方法对膜上蛋白进行可逆性染色。1. 氨基黑染色染液：0.5% Amido Black (w/v), 25% isopropanol (v/v) and 10% acetic acid. 染色：将 PVDF 膜置于染液中染色数钟， ddH2O 脱色。2. 考马氏亮蓝染色染液：0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250 (w/v) and 50% methanol

11、(v/v) 脱色液：40% methanol (v/v) with 10% acetic acid (v/v)染色：将 PVDF 膜置于染液中染色 15 min.，脱色液脱色。3丽春红染色 Ponceau S染液：0.2% w/v Ponceau S in TCA (3% v/v)染色：将 PVDF 膜置于染液中染色 5min脱色：ddH 2O 脱色三、银染PAGE 胶上蛋白质的银染方法有数百种，其原理相似，具体步骤各不相同。银染为蛋白质的非特异性染色，呈“爆炸性”反应模式，用于蛋白定量时准确性差，但其敏感度高、简便易行，仍被广泛应用。下面列 举 的这三种方法为常用的双向电泳凝胶染色法，可与质

12、谱 兼容。其中方法 1 敏感性最高，方法 3 背景最低、对比度好。1. Blam silver staining protocol (Modified)程序 溶液 时间固定 40%ETOH10%HAC1 小时漂洗 30%ETOH 220min致敏 0.02%Na2S2O3 1min漂洗 H2O 320Secs染色 0.1%AgO3(预 冷) 4，20mins漂洗 H2OH2O(更换盘子)320Secs1min显色 3%Na2CO30.05%甲 醛漂洗 H2O 20Secs中止 5%Hac漂洗 H2O 310min贮存 1%Hac,42. EMBL Silver Staining Protoco

13、l程序 溶液 时间固定 50%MeOH5%HAc20min漂洗 H2O 2hr 或过 夜致敏 0.02%Na2S2O3 1min漂洗 H2O 21min染色 0.1AgNO3 (预冷) 20min漂洗 H2O 21min显色 2%Na2CO30.04%甲 醛 中止 5% HAc贮存 1% HAc，43. Vorum Silver Staining Protocol程序 溶液 时间固定漂洗致敏漂洗染色漂洗显色中止50%MeOH12%HAc0.05%甲 醛35%EtOH0.02%Na2S2O3H2O0.2AgNO30.076%甲醛H2O6% Na2CO30.05%甲 醛0.0004% Na2S2O350%MeOH12%HAc2hr 或过 夜320mins2min35mins20min35mins5mins贮存1%HAc，4注意事项：1. 应严格按照操作步骤进行；2. 显色前最好更换新染色盘；3. 显色时变为黄色或棕色后立即弃去，更换新鲜显色液，一般来说染一块胶应配制 500ml 染液。更换 2-3 次；4. 市售甲醛的浓度为 37%；5. 三种方法均与质谱兼容，Blum 法敏感性高，但背景呈淡黄色，EMBL法次之但背景较低，染色点较黑。 Vorum 相对不敏感，但背景清晰，信噪比高。6.需要相关抗体试剂的可以访问 Fantibody 全球抗体搜索引擎：http:/