基因免疫构成和机理.doc

1、基因免疫构成和机理(Genetic Immunity) 基因免疫，又称基因疫苗免疫或核酸免疫；是应用基因重组技术将编码的目的抗原蛋白基因插入细菌质粒内，构建成重组体，将其直接导入动物机体内，通过宿主细胞的转录系统，表达抗原蛋白，从而诱导宿主产生特异性体液免疫及以 CTL 为代表的细胞免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。这种能诱导动物机体产生免疫应答的重组体，就是核酸疫苗，或称基因疫苗(genetic vaccine)、裸 DNA 疫苗(DNA vaccine)等，系该章讨论的重点内容。基因直接导入法最初用于基因治疗试验。人们发现将基因直接在体内转染细胞，目的基因亦可在机体内表达。1990 年

2、 Wolff 等总结了前人的成果，并对此进行了较深入的研究。他们将氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)、虫荧光素酶基因(Luc)及 半乳糖苷酶基因(LacZ)分别直接注射到小鼠的骨骼肌内，结果表明在肌肉组织可分别检测到三种基因产物，它们的表达量可与在体外最佳条件下转染成纤维细胞的表达量相当，两个月以后，肌肉内还可检测到虫荧光素酶。据此，他们认为向机体直接导入基因以表达抗原蛋白，可以作为一种免疫接种法。1992 年 Tang 等将人生长激素基因的质粒 DNA 导入小鼠表皮细胞，几周后，88%(3034)的小鼠产生了抗人生长激素的抗体。此后，许多学者先后将不同病原的保护性抗原基因直接导入到不同的动物体内

3、，均引起了特异性的免疫应答，不仅诱导细胞免疫，也刺激产生体液免疫。目前，基因疫苗已成为继减毒疫苗及基因工程疫苗之后，正在兴起研究的第三代疫苗，巴斯德研究所的 Whalen 博士在 Internet 网上建立了有关基因疫苗研究的网址，每周发布 23 次新闻，内容主要包括:最新消息，会议讯息，研究进展，最新文献，有关基因疫苗研究试剂与器材的供求信息等。一、 基因疫苗的构成基因疫苗由病原的保护性抗原基因及载体质粒两部分构成。保护性抗原基因可以是单个基因，也可以是具有协同保护功能的一组基因，也可以是编码抗原决定簇的一段核苷酸序列。对载体质粒的一般要求是：在大肠杆菌中可以高拷贝地扩增；在动物细胞内高效表

4、达，但不能复制，也不能含有促进整合入宿主细胞染色体基因组的序列。载体质粒一般以 pUC 质粒为基本骨架，带有细菌复制子(ORI)，真核生物的启动子，有的还含有增强子和多聚 A 加尾信号。启动子多数来源于病毒基因组，如 CMV，RSV 和 LTR 等，具有较高的转录活性。在所有研究过的启动子中，以 CMV 的转录活性最高，其中又以带 intron A 的转录活性为高，intron A 内部含有某些转录因子的加尾信号，可能是其促进转录的原因。二、 基因免疫的机理目前，人们对基因的免疫机理尚不十分清楚。给动物肌肉接种基因疫苗后，外源基因在肌纤维细胞内表达，所表达的外源蛋白在细胞内加工成多肽抗原，然后

5、与宿主的 MHC-类或 MHC-类分子结合，再将其结合物递呈给 ICC，从而引发特异性免疫应答。目前，人们对这一抗原递呈过程所知甚少，一般认为树突状细胞(DC)在该过程中起重要作用，因为，在肌肉中发现存在有 DC，但这并没有直接的抗原递呈实验证据。Raz 等(1994)将基因含流感病毒 NP 的质粒皮下接种小鼠，接种后分别在第 3、10 和 30 天用免疫组化法染色接种部位，发现阳性细胞有：角质化细胞，成纤维细胞，树突状细胞。说明这些细胞在动物接种基因疫苗后的免疫应答中起作用。关于肌细胞在基因疫苗免疫机理中的作用，目前有以下三种观点：肌细胞直接参与目的基因 DNA 的摄入和表达，并递呈给免疫系

6、统，产生免疫应答，骨骼肌组织中可能存在尚未被发现的抗原递呈细胞，其作用类似于皮肤组织中的朗格罕细胞；肌细胞不直接参与免疫应答，蛋白质抗原从肌细胞分泌出来后，被巨噬细胞和或树突状细胞吞噬、处理、递呈，分别与 MHC-类和-类分子结合，诱导细胞毒 T 淋巴细胞(CTL)前体、B 细胞和特异性 Th 细胞活化，产生细胞免疫和体液免疫应答；基因疫苗免疫时，肌细胞和抗原递呈细胞均被转染，引起 CD4 T 细胞和 CD8 T 细胞亚群同时活化，产生特异性免疫应答。三、 基因免疫的特点用于传染病预防的常规疫苗主要有：灭活疫苗和弱毒疫苗两类。弱毒疫苗诱导的免疫应答与病原自然感染机体后产生的相似，均包括细胞免疫

7、和体液免疫，因此，反应强而全面，且持续时间较久，但它有毒力回升、返祖的危险。灭活疫苗在灭活过程中常造成重要抗原表位的丢失，接种动物后难以产生全面的免疫。重组活疫苗是基因工程技术出现后产生的新一代疫苗，虽然与弱毒疫苗一样可以诱导产生细胞免疫和体液免疫，但因其病毒载体具有免疫原性，重复使用可引起机体对载体本身的免疫应答，因此，不能反复使用。与以上这些疫苗相比较，基因疫苗有以下特点：基因疫苗接种后，保护性抗原基因在宿主细胞内表达抗原蛋白后，其加工处理过程与病原的自然感染过程相似，同时，两者的抗原递呈过程亦相同，因而，可以与自然感染病原微生物一样，诱导接种动物既产生细胞免疫又产生体液免疫，这是灭活苗和

8、亚单位苗所不能比拟的；免疫应答持久，由于外源基因可以在体内存在较长时间，并不断表达外源蛋白，它可以持续地给免疫系统提供刺激，因此，微量的抗原即可刺激机体产生强而持久的免疫应答；基因疫苗具有共同的理化特性，可以将含不同病原基因的质粒混合起来进行联合免疫，或是将不同病原的保护性抗原位点一同组装入一个质粒，构建成多价疫苗；质粒载体不存在免疫原性，因此，可以反复使用，这避免了重组活疫苗的弊病；质粒 DNA 性质稳定，保存和运输方便，可以大大降低这两方面的费用，也可避免因保存和运输不当而造成的免疫失败，这一特点是一切传统疫苗所不具备的；直接接种目的基因 DNA，避免了疫苗制备所需的繁琐过程，也有利于控制

9、和保证质量；作为一种重组质粒，基因疫苗能在工程菌内快速增殖，且提纯方法简便，可大大降低疫苗的成本；对危险病原，如 Ebola 病毒等，基因疫苗是制备免疫原的最安全的方法；基因疫苗没有常规疫苗和灭活疫苗可能因毒力返祖或残留强毒力病毒颗粒而引发疫病的危险。四、 基因免疫的主要生物学特征（一） 基因免疫的动力学 基因免疫产生抗体的动力学与蛋白抗原免疫不同，其潜伏期较长，接种后一般要 23 周才有抗体产生，而抗体产生后却可在比较长的时间内维持较高的水平，在小鼠甚至可持续终生。但也有例外，如以 HIV Env 疫苗质粒免疫动物后，免疫反应较短，在高峰期间只能维持 24 周; 而蛋白抗原免疫的潜伏期一般为

10、数天，抗体水平到达高峰后下降速度较快。（二） 基因免疫诱导的应答水平 非毒性蛋白的基因疫苗免疫应答水平与其表达水平成正比，而毒性蛋白的表达水平却不能太高，否则免疫应答水平可能反而下降。在小鼠，免疫应答水平与其年龄成负相关，其原因之一是年龄越大，疫苗质粒接种后的表达水平越低。 （三） 基因免疫诱导的免疫应答类型与接种途径的关系 基因疫苗肌肉接种免疫反应以 Th1 型反应为主，所产生的抗体主要是 IgG2a，而基因枪接种以皮内 Th2 型反应为主，所产生的抗体主要是 IgG1。（四） 基因免疫抑制特异性 IgE 的产生 Raz(1996)等以 pCMV-lacZ 免疫小鼠，发现质粒免疫可抑制动物产

11、生 IgE。他们先给小鼠免疫纯化的 -gal，结果可诱发 IgE 的产生。然后，以 pCMV-LacZ 进行第二次免疫，结果 IgE 的水平降低 66%75%，这种抑制作用具有特异性。因为以 pCMV-OVA 替代 pCMV-lacZ 进行第二次免疫，并不出现这种抑制作用。因此，作者认为以编码过敏原的表达质粒进行免疫有可能用于过敏性疾病的治疗。（五） 基因免疫可使无反应性动物产生免疫应答 如以 HBsAg 表达质粒免疫 HBsAg转基因鼠，亦可诱导动物产生特异性免疫应答，而在一般情况下，HBsAg 转基因鼠对HBsAg 是不产生免疫应答的。（六） 基因疫苗与一些细胞因子的表达质粒共同免疫，可使

12、免疫应答类型发生改变 如与 IL-12 和 IFN- 表达质粒共同免疫，基因疫苗的免疫应答类型主要是 Th1，而 Th2 反应受到抑制。相反，IL-4 表达质粒可显著增强 Th2 反应， 而 Th1 反应受到抑制。另外，基因疫苗接种新生动物可诱导出较强的免疫应答，不受或较少受母源抗体的影响。基因疫苗质粒既是抗原信息的携带者，同时又具有佐剂作用。五、 影响基因疫苗免疫效果的因素（一） 保护性抗原基因的选择 应选择病原体的主要保护性抗原基因，也可以将具有协同功能的基因共同组装入载体质粒。同时，还应注意尽可能选择对多数毒株都有保护作用的抗原基因。另外，保护性抗原基因编码的抗原结构，对 DNA 疫苗的

13、免疫应答水平也能产生一定影响，如信号肽序列的有无，密码子的使用情况，抗原蛋白的稳定性，抗原蛋白是膜结合型，还是分泌型等，制苗时都应予以充分考虑。（二） 载体质粒的选择 除上述载体的启动子和终止子等是影响基因疫苗免疫应答水平的重要元件外，还有载体内部其它一些序列和载体质粒的状态亦影响基因疫苗的应答水平。Montgomcry 等比较了两种含流感病毒神经氨酸酶(NP)基因的质粒 V1 和 VJ1 在小鼠体内的表达效果。V1 的骨架来自 pBR322，而 VJ1 的骨架为 pUC19。结果表明 VJ1 的表达水平明显高于 V1 的水平。两者的启动子，增强子，加尾信号等均相同，所不同者，除质粒骨架有异外

14、，还在 VJ1 的启动子 CMV 内去掉了一段 500bp 的序列，而 V1 的启动子未作任何改造。实验表明：这段序列含有基因表达的负调控区，可抑制基因在 COS1 细胞和 CHO 细胞中的表达。Danko 等发现，共价闭环(CCC)型质粒 pRSCLDNA 的表达效果远高于线性化质粒 pRSVLDNA。但 Sakaguchi 等在对新城疫基因疫苗的研究中却发现线性化的质粒优于闭环质粒。（三） 免疫刺激序列的作用 人们发现 6 核苷酸链：5RRGCYY 3(R=A 或 G、Y=C 或T)具有较强的非特异性免疫增强作用，该序列被称为免疫刺激序列(ISS)，他可诱导机体产生 IFN-、IL-6、I

15、L-12、TNF，以及促进 B 细胞的增殖，从而增强免疫应答强度。Sato 等(1996)证实：天然含有 ISS 的核酸疫苗所诱导的免疫应答水平较不含 ISS 的要高 20 余倍。ISS 在基因疫苗中的作用已受到学者们的广泛关注。（四） 免疫调节因子在 DNA 疫苗中的作用 为提高 DNA 疫苗的免疫应答水平，许多研究者将免疫调节因子的基因克隆到 DNA 疫苗质粒中，使之与病原的保护性抗原基因共同表达， 以促进基因疫苗的免疫应答水平。如 Larsent 等将人的 IL-6 基因与马流感病毒的血凝素(HA)基因共同构建成疫苗质粒，以其接种小鼠，小鼠可以抵抗马流感病毒的攻击，而接种仅含 HA 基因

16、的质粒的小鼠却只能减轻病毒攻击后的感染。Kim 等将 IL-12 和 GM-CSF基因分别与 HIV-1 的疫苗质粒共同免疫小鼠。结果 IL-12 抑制特异性抗体的产生，但却使免疫应答的类型由 Th2 转向 Th1，并显著促进特异性 CTL 反应。已被用于这一目的免疫调节因子种类很多，除上述提到的外，还有 IL-1、IL-4 、IL-5、IL-10、IL-15、IL-18、TNF-、TNF-、IFN- 等细胞因子 和 CD28、CD86(B7-2)、CD80(B7-1)等共同刺激因子。（五） 基因疫苗质粒的纯化 基因转移对质粒的质量要求非常高。质粒应该主要以超螺旋形式存在，无蛋白，脂多糖(LP

17、S)含量低。由于基因疫苗所需质粒数量较大，因此，提取质粒的回收率应该较高才能满足要求。早期主要用 CsCl 密度梯度离心法获得高质量的质粒，但该方法成本高，回收率低。目前，多数用商品化的层析柱，其中 Qiagen 公司的 AX层析柱是其中较为优异的一种，也是在实际工作中应用最多的。但即使如此，AX 层析柱提取的质粒的 LPS 含量仍不低，回收率也不高。LPS 是大肠杆菌细胞壁的一种成份，与 DNA一样带负电荷，分子量不均一，因此，较难从质粒中除去。所幸 LPS 对基因免疫有双重作用，一方面 LPS 影响基因的转移，降低其表达水平，另一方面 LPS 是一种有丝分裂原，具有疫苗佐剂的作用。有实验表

18、明，质粒中低水平的 LPS 具有促进基因免疫的作用。但该实验所用动物是小鼠，小鼠对 LPS 的耐受性较大，该实验结果是否适用于其它动物，是否具有普遍意义，有待进一步的试验。Wicks 发明了一种提取质粒的方法，所提质粒 LPS 含量与二次 CsCl 密度梯度离心所提质粒的相当，但质粒的回收率是 CsCl 密度梯度离心纯化法和商品化层析试剂盒纯化法的 510 倍。（六） 免疫途径 Fynan 等详细研究过基因疫苗不同注射途径的免疫效果，结果免疫动物的阳性率分别为：肌注(i.m.)95%，静脉注射(i.v.) 83%，鼻内接种(i.n.) 76%，皮内(i.d.) 75%，皮下(s.c.) 67%

19、，腹腔接种(i.p.)0%。但这一结果无严格的可比性，因他们所使用的剂量在各种途径不完全一致，如 i.m.为 200ug，i.d.为 50ug，其余均是 100ug。相反，有的实验结果表明皮内注射的免疫应答效率却较肌肉注射的高 4 倍，Fynan 在同一实验中发现将 DNA 吸附在金粉颗粒上，然后用基因枪将金粉颗粒导入皮内，结果发现达到同样免疫效果所需的 DNA 量低于其它方法的 2502500 倍。这说明基因枪是一种十分高效的接种方法。一般认为，免疫效果与体内的转染率(DNA 摄取能力和基因表达水平)和转染细胞递呈抗原蛋白给免疫系统的效率两个因素有关。目前人们认为横纹肌是唯一能高效摄取并高效

20、表达外源基因的组织，其效率是其它组织的 1001 000 倍；但肌肉内免疫活性细胞(ICC)却很少，肌肉细胞所表达的外源蛋白递呈给淋巴细胞的效率低，因此，通过肌肉接种的免疫效果在理论上并不较其它组织好，这是须要今后继续探讨的问题。皮肤是机体防御病原的第一道屏障之一，其中存在有多种 ICC，如淋巴细胞，巨噬细胞，树突状细胞。皮肤内的角质化细胞可以产生 IL-1 和 TNF-，进而活化 ICC。皮肤内的 Langerhans 氏细胞在接触抗原后也能有效激活 T 淋巴细胞。并且，巨噬细胞和树突状细胞也可摄取抗原并引发免疫应答。因此，有理由认为皮内接种可为抗原递呈提供十分有效的途径。与皮肤一样，粘膜内

21、亦含有十分丰富的 ICC，它在抵抗感染过程中起到很重要的作用，Fynan 的实验表明鼻内粘膜接种确可产生较好的免疫效果，但由于解剖位置的限制，接种不方便，这方面的研究还很少。（七） 接种剂量、次数及容积 许多研究表明，免疫应答及保护率与接种剂量(1100ug)和次数均呈一定程度的正相关。但不同的实验之间差异较大，且低剂量时(50ug以下)所得结果差异较大。如 Yankanchas 等在实验中发现给小鼠接种 2g 的 DNA，有的可产生很高水平的免疫应答，但有的则没有。Raz 等用皮内接种的方法研究剂量与免疫应答的关系时发现，这种相关性只在接种的初期明显，他们用 3100g 的含 NP 的质粒皮

22、内接种小鼠，发现接种初期，剂量越大，免疫应答越强，且出现越早，但 34 周以后，所有接种动物的抗 NP 抗体滴度几乎相同。接种物的容积也很重要，Davis 等用同样量的 DNA 溶于 10l 和 50l 的溶液中，然后 i.m 接种小鼠，结果表明 50l 的表达水平高，且结果比较一致，而 10l 的表达水平低，结果相差较大。（八） 接种部位组织的预处理 Davis 等(1993)用高渗 (25%)蔗糖溶液在接种前 1530分钟预先注入接种部位，然后接种质粒 DNA，结果发现，基因的表达水平较不作预先处理者提高，且结果比较一致。Davis 等(1994) 在另一次实验中发现，在实验小鼠的接种部位

23、预先注射心肌毒素，然后免疫，其抗体水平较对照组(预先用 25%蔗糖处理者)高 10 倍以上。Danko 等报道，免疫前，于接种部位的肌肉组织用蛇毒或局麻药处理，可使外源基因的表达提高 40 倍以上。Vitadello 等的实验结果表明，丁派卡因预处理可使肌肉接种的 CAT 基因表达量提高 80 倍， 但丁派卡因对 HSV 基因免疫的促进作用很小甚至没有。Kriesal 等发现维生素 D3 亦能促进基因疫苗的免疫应答水平。六、 基因疫苗的抗原基因和实验动物根据接种对象，基因疫苗可大致分为 3 类：预防传染病(包括寄生虫病)的基因疫苗、治疗癌症的基因疫苗和抗过敏的基因疫苗等。而以用于预防传染病的基

24、因疫苗的研究为多，目前，已报道的预防传染病的基因疫苗有 50 多种，而研究最多的是以下几种疾病：艾滋病、乙型肝炎、狂犬病、流感等。许多基因疫苗的技术环节均是通过研究这 3 种疾病的基因疫苗而获得的。现将研制预防传染病 DNA 疫苗所用保护性抗原基因及实验动物列表 1141:表 1141DNA 疫苗所用的抗原基因及实验动物病毒保护性抗原基因实验动物人,马,禽流感病毒血凝素(HA)、M 蛋白、核蛋白(NP)小鼠，雪貉，非洲绿猴,鸡BHDW新城疫病毒融合蛋白(F)、血凝素神经氨酸酶(HN)鸡BH狂犬病毒糖蛋白(gP)小鼠BHEbola 病毒糖蛋白(gP)豚鼠HJ续表病毒保护性抗原基因实验动物牛疱疹病

25、毒糖蛋白(gIV)、糖蛋白 D(gD)小鼠，犊牛BHDW鼠巨细胞病毒长区段蛋白(PPUL89)小鼠BH口蹄疫病毒全基因组豚鼠BH伪狂犬病病毒糖蛋白 D(gD)仔猪BH鸡马立克氏病病毒糖蛋白 B(gB)鸡BH鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白 B(gB)鸡BH鸭乙型肝炎病毒前 S/S 和 S 蛋白鸭BH猫免疫缺陷病病毒全基因组猫BH猴免疫缺陷病病毒囊膜蛋白(Env)、核心蛋白（Gag）猴BH传染性造血器官坏死病病毒核蛋白、糖蛋白虹鳟鱼BH日本乙型脑炎病毒核蛋白、糖蛋白豚鼠BH猪瘟病毒糖蛋白 E2(gP55)小鼠，家兔BH牛腹泻 粘膜病病毒糖蛋白 E2(gP53)小鼠BH轮状病毒衣壳蛋白 VP4、VP6、

26、VP7小鼠BH猴多瘤病毒 SV40肿瘤抗原小鼠BH棉尾兔乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白 L1棉尾兔BH淋巴细胞性脉络丛病毒糖蛋白、核蛋白小鼠BH朊病毒细胞 PrP(PRNP)小鼠(prp0/0)BH犬细小病毒VP1犬BH传染性支气管炎病毒核蛋白鸡BH圣路易脑炎病毒膜蛋白和囊膜糖蛋白(prM/E)小鼠BH森林脑炎病毒非结构蛋白(NS)小鼠BH俄罗斯春夏脑炎病毒膜蛋白和囊膜糖蛋白(prM/E)小鼠BHEpsteinBarr 病毒糖蛋白(gP350)小鼠BH结核杆菌hsp65、Ag85小鼠BH牛布鲁氏菌L7/L12小鼠BH肺炎链球菌肺炎球菌表面蛋白 A(PspA)小鼠BH破伤风毒素C 片段小鼠BH疏螺旋体

27、(莱姆病)OspA小鼠BH肺炎支原体基因组表达文库、A71 和 A81 抗原小鼠BH日本血吸虫副肌球蛋白小鼠BH羊绦虫45 抗原绵羊BH弓形虫p30 蛋白小鼠BH泰勒氏焦虫主要裂殖子表面抗原小鼠七、 基因疫苗免疫的安全性问题人们对这一问题考虑得最多的有两方面: 一是动物在接种 DNA 疫苗后，外源基因是否可能整合入宿主细胞的染色体，然后导致细胞转化，发生癌变；二是 DNA 疫苗是否会诱发产生抗 DNA 抗体并导致动物发生自身免疫性疾病。Nichols 对外源基因进入细胞后是否与宿主细胞的染色体基因组发生整合进行了大量的研究，但并未发现有整合的证据。笔者认为外源基因进入细胞后，存在整合入染色体基

28、因组的可能性，但不同性质的基因整合后发生的生物学效应差异很大，有的容易导致转化如逆转录病毒，DNA 肿瘤病毒，有的则不易发生转化。作为基因疫苗，DNA 分子中有表达高免疫原性蛋白的外源基因。如果被整合入细胞染色体基因组并导致细胞转化，则这样的细胞不可能长期存活下去，因为转化细胞带有可被 ICC 识别的抗原，而被宿主的免疫系统消灭。肿瘤之所以存在，其中一个重要因素是肿瘤细胞的抗原性弱，不易被 ICC 所识别，因此，从这方面讲，DNA 疫苗应该是安全的。至今，绝大多数研究表明 DNA 疫苗不可能诱发抗 DNA 抗体。因为疫苗质粒是双链DNA， 而双链 DNA 一般不会诱导抗自身抗体产生，即使人们有

29、目的诱导动物产生抗双链DNA 抗体也是一件不容易的事。Mor 等的研究表明，在接种 DNA 疫苗后，小鼠体内分泌抗DNA 自身抗体 B细胞数量增多 3 倍，而血清中的抗 DNA 自身抗体滴度只短暂升高，但这与自身免疫性疾病无关。他们用易患狼疮(一种自身免疫性疾病)的 NZBNZW 杂交小鼠所作的研究表明，接种DNA 疫苗并不能激发小鼠的这种疾病，亦不会改变该病的发病过程。 因此，Mor 等认为DNA 疫苗既不会引发也不会加重全身性自身免疫性疾病的发生。八、 基因疫苗免疫的发展前景基因疫苗是近几年发展起来的一种新型疫苗，世界上许多国家的科学家对此进行了大量的研究。自 20 世纪 90 年代以来，

30、每年有关这方面的研究报告直线上升。1994 年 5 月，WHO 召开了基因疫苗国际会议，会议充分肯定了核酸疫苗的应用前景。2000 年 3 月，科学家报道了 HIV 基因疫苗的人体试验，9 个 HIV 感染无症状者接受了免疫接种，试验前他们没有或只有很低的抗 HIV 免疫应答，免疫后均产生 HIV 特异性 CTL 应答。同年 4 月Stephen 等(自 Internet)进行了疟疾基因疫苗的 I 期临床试验，该试验的目的是评价疟疾基因疫苗的安全性和诱导产生免疫应答的水平，实验结果良好。Stephen 等准备作 II 期临床试验，以确定疟疾基因疫苗诱导的保护性免疫应答。动物接种基因疫苗后产生免

31、疫应答是肯定的，对其应用的忧虑主要是安全性问题，但迄今，并未在实验中发现存在安全性问题的证据，尤其是当应用于动物，可较少考虑这方面的问题。实际应用之前，还应解决的一个问题是基因疫苗免疫程序的规范化。目前，尚没有行之有效的关于基因疫苗的接种剂量、接种次数、接种途径以及预处理等方面的实验资料。由于基因疫苗接种剂量少，而受各种因素的影响大，因此，不同研究者的研究结果差异较大，这无疑是实际应用之前必须要解决的问题。（一） 今后研制基因疫苗的主要对象 据报道，以下四方面应是研制基因疫苗的重点：1. 不能或难于培养的病原 如乙型肝炎病毒(HBV) 、丙型肝炎病毒(HCV) 、戊型肝炎病毒(HEV)、人乳头

32、瘤病毒(HPV)、麻风杆菌、EB 病毒(EBV) 、血吸虫、结核分枝杆菌、兔出血症病毒、鸡马立克病毒、鸡传染性贫血病毒等。2. 有潜在致癌性或有免疫病理作用的病原 前者如 I 型嗜人 T 淋巴细胞病毒(HTLV-1)、人免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)、EBV、HPV、马传染性贫血病毒等。后者如呼吸道合胞病毒(RSV)、登革热病毒(GDV)、阿留申病病毒(ADV)和猪呼吸繁殖综合征病毒(PRRSV)。 3. 易变异的病原 流感病毒、轮状病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒等。4. 可能大大节约成本，简化免疫程序的多价疫苗。（二） 基因疫苗在其他方面的应用1. 制备高

33、免抗血清 Sundaramp 等将表达 半乳糖苷酶(-gal)的质粒 pCMV-LacZ 和棉尾兔多型瘤病毒 L1 衣壳蛋白的质粒 pCMV-CRL1 分别包被在金粉颗粒上，然后用基因枪皮内免疫兔，免疫剂量为 30ug 质粒，免疫方法为分 30 点免疫，每点 1ug 质粒，共免疫3 次。结果，第一次免疫后，血清用 ELISA 检测，其特异性的抗体效价即可达 1：24 0001：120 000。加强免疫后抗体效价略微上升到 1：8 0001：120 000。这说明将表达质粒用基因枪的方法接种动物是一种非常有效的制备高免血清的方法，并且这样制备的血清特异性好，成本低，尤其对难于纯化的抗原或来源有限

34、的抗原，该法更有其优越性。2. 制备单克隆抗体 Barry 等以人生长激素(hGH)的表达质粒免疫 BALB/c 小鼠 3 次后，取免疫小鼠的脾细胞与 SP2/O 骨髓瘤细胞融合，结果获得了 34 个稳定分泌 hGH 特异性抗体的阳性杂交瘤克隆。3. 研究病原的保护性抗原 以往研究某一病原的保护性抗原的方法，一般是先分离纯化该病原的各种抗原，然后将获得的抗原免疫动物，观察是否可诱导动物获得保护性免疫反应。另外一种研究方法是先制备获得具有中和活性的 McAb，然后用这种 McAb 分析病原的各种抗原。这两种方法均费时、费力，并且可能筛选不到所有的保护性抗原。基因疫苗出现后，这一工作将变得较为容易

35、。方法是先构建病原的基因组表达文库，然后，用该文库免疫动物，并从文库中筛选能获得可诱导产生免疫保护反应的抗原基因。由于构建病原的基因组表达文库相对较纯化抗原和制备 McAb 容易得多，并且可获得病原的所有抗原信息，因此，该方法的优越性是显而易见的。相关帮助需要相关抗体试剂的可以访问 Fantibody 全球抗体搜索引擎fantibody 全球抗体搜索引擎是一个供公共检索的抗体数据库，其抗体信息数据来源于全球范围的研究机构与商业公司。该引擎由商品化抗体数据库与抗体应用评价数据库两部分组成，以帮助研究者更高效的寻找并评估该抗体的性能。全球抗体搜索引擎是继基因与蛋白数据库之后更为复杂的应用型检索平台，网址：http:/需要相关的实验室仪器设备、生物试剂、医疗器械、制药设备、医药原料、体外诊断试剂及耗材与技术服务信息的，可以访问探生网进行咨询，期待您的加入：http:/