1、中华鳖脾脏 cDNA 文库构建及其 CD3/，CD3 分子的克隆中华鳖是我国一种珍贵的、经济价值很高的水生动物。全国各地已经广泛开展其人工养殖，然而，在水体中还存在很多危害中华鳖的致病菌，对水产养殖构成巨大威害。另外，我们对于爬行动物免疫分子的认识处于初级阶段，是在所有脊椎动物类群研究中了解最少的。然而爬行动物处于动物从水生到陆生的重要阶段，因而在进化上具有重要的意义。但是国内外对中华鳖免疫系统与免疫反应规律的研究甚少，因此对中华鳖主要免疫基因组成和免疫应答规律的研究具有重要意义，并且这些研究成果将在中华鳖的健康养殖和病害防治等方面也具有一定的指导意义。以细菌脂多糖刺激中华鳖的脾脏为材料，应用
2、 clonminer 的 cDNA 文库构建试剂盒（Invitrogen）构建了中华鳖脾脏的 cDNA 文库，文库滴度为1.73106pfu/ml,含有 1.38107 个重组子，重组率为 91%，cDNA 插入片段大小在0.3-2kb 以上，平均插入片段大小为 1.2kb。对文库中部分克隆 EST 测序，经NCBI 数据库中进行比对，结果获得一些免疫相关的 EST，如CD151，CD20，CD3/ ， CD46， 2 微球蛋白，补体调节蛋白，C 型凝集素，B-型凝集素，免疫球蛋白 J 链，免疫球蛋白 链，免疫球蛋白 链结合蛋白，Fc 受体，胸腺素，Fc 受体等，为进一步研究爬行动物分子免疫奠
3、定一定的基础。CD3 分子是 T 总淋巴细胞的标记分子，它以 TCR-CD3 复合物的形式存在，TCR 识别抗原后，CD3 分子中的 ITAM 将其 T 细胞活化信号传递到胞内。本研究通过构建中华鳖脾脏 cDNA 文库获得部分 EST 序列，通过 RACE 方法扩增出CD3/ 链全长 cDNA。其 cDNA 全长为 971nt，包含 5非编码区 134nt，3非编码区 324 nt，开放阅读框 513 nt，编码 170 个氨基酸。其预测的氨基酸序列包括22 个氨基酸组成的信号肽，胞外区，跨膜区，以及胞浆区，胞外区含有保守的CXXC 结构域，胞浆区含有一个保守的 ITAM 结构域。应用生物软件
4、对中华鳖CD3/ 氨基酸序列与其他物种的氨基酸序列进行同源性分析，结果显示中华鳖/ 和鸡的 / 相似性最高，达到 59%。将其胞外部分构建原核表达载体pET32a-CD3，重组蛋白在大肠杆菌内以包涵体的形式表达。通过同源序列分比较析并设计兼并引物，用 PCR 和 RACE PCR 的方法获取到 CD3 链的 cDNA序列。其 cDNA 全长为 1460nt，包含 5非编码区 24nt，3非编码区 929 nt，开放阅读框 507 nt，编码 168 个氨基酸。其预测的氨基酸序列包括信号肽，由 10 个氨基酸组成的胞外区，跨膜区，以及胞浆区，而且胞浆区含有三个保守的ITAM 结构域。应用生物软件
5、对中华鳖 CD3 氨基酸序列与其他物种的氨基酸序列进行同源性分析，结果显示中华鳖 CD3 和鸡的 CD3 相似性最高，达到86%，其次为人（77% ） ，大鼠（74%） ，小鼠（74%） ，非洲爪蟾（64%） 。对CD3/，CD3 的系统进化树分析，结果均显示爬行类的 CD3 分子跟鸟类的CD3 分子聚为一枝，进化关系最近。实验后期工作一方面通过同源克隆中华鳖 CD3， CD4，CD8 T 细胞表面标记分子，并研究其表达规律；另一方面将制备 CD3 单克隆抗体，分离出 T 细胞，为以后的功能研究奠定基础。关键词：中华鳖；脾脏；cDNA 文库；CD3/；CD3相关帮助本文由探生网技术人员提供，如果您想了解更多的信息，可以访问全球抗体搜索引擎查找相关抗体，希望对您有帮助！抗体应用，找抗体，抗体定制，抗体搜索，抗体制备，抗体公司相关实验试剂和器材：http:/ http:/
