Direct survival role of vascular endothelial growth factor on rat ovarian follicular cells.doc

1、Direct survival role of vascular endothelial growth factor on rat ovarian follicular cells前言雌性生殖系统是研究成体血管发生的一个有趣的模型，因为它面临着许多生成血管的过程加上周期进化和衰退（卵巢，子宫内膜，胎盘结构） 。相反，维管系统在其他组织是普遍静止的，除了伤口愈合和一些病例条件下。VEGF 家族和他的受体在血管发生中构成了一个重要的信号通路,在近 20 年来研究的比较深入。七个家族成员已经被鉴定，VEGF-A 到-E。胎盘生长因子（ PIGF）-1 和-2，他们都是通过三酪氨酸激酶受体，VEGFR

2、-1 到 3 发信号的。特别的，VEGFA(通常被称为VEGF)在血管发生中是主要的参与因子，VEGFR2/KDR 是主要的受体。VEGF,acting through Flk-1/KDR is a crucial physiological component in follicular growth, being necessary for the selection of recruited antral follicles。在牛，猪，鼠类卵巢中，VEGF 在早期卵泡发育过程中表达，而且在卵泡生长的全部过程中在颗粒细胞和卵泡膜细胞表达量增加。我们最近的研究表明 VEGF 蛋白和其受体 V

3、EGFR2/KDR，在大鼠卵泡的颗粒细胞和卵泡膜细胞中有高表达。一些研究已经对在卵泡发育中 VEGF 的功能进行研究。在小鼠上，用一种特殊的抗体抑制 KDR 来抑制促性腺激素依赖的卵泡血管发生并且阻拦成熟卵泡的发育。服用 VEGF TRAP ，一种来自猴的可溶性 VEGF 受体，可以使卵泡血管发生减弱，FLT1 和 KDR 受体发育减缓。而且，在早期卵泡发育中加入抗 VEGFR2 抗体可以干扰卵泡的正常发育。 （Moreover, the administration of an anti-VEGFR2 antibody in the early follicular phase interf

4、eres with the normal development of the cohort of recruited antral follicles） 。在恒河猴卵泡内注射 VEGF 拮抗剂可以降低排卵和后续的黄体发育及其功能。在我们的研究中，我们发现用 Trap 处理来抑制 VEGF 可以使抗细胞凋亡的比例失调：在大鼠卵巢中可以导致大量卵泡闭锁的凋亡前的蛋白。除了它的促血管生成作用，在不同的细胞中 VEGF 还是一个存活因子。特别是它在内皮细胞通过它的受体 KDR 促进有丝分裂，这在体内和体外都以证明。但是，这个因子同时还能在神经元中起到保护细胞的作用，通过抑制凋亡，刺激神经形成，在中枢

5、神经系统起到 gliotrophic 作用，并且在局部缺血后，在肌细胞起到存活因子的作用。近几年，还报道 VEGF 在小鼠胚胎时期对眼的发育和晶状体的分化有直接的作用。但是，迄今为止，很少由关于 VEGF 在大鼠卵巢细胞的存活因子的角色，特别是在早期卵泡和颗粒细胞的培养中。已经指出在牛卵泡中可能充当存活因子的角色，通过它的 KDR 受体，在牛卵巢中通过抑制颗粒细胞的凋亡来抑制卵泡闭锁。VEGF 通过它的主要受体 VEGFR2/KDR 在内皮细胞形成了一个多样的，网络状的信号通路，产生了多功能性。这个 VEGF 促进细胞存活的主要的通路是 P13K 依赖的抗细胞凋亡激酶和 AKT/蛋白激酶 B

6、的激活。VEGF 也可以在其他细胞中激活 P13/AKT 途径，例如神经元和平滑肌细胞。另外，VEGF 是 ERKs1 和 2 的强烈的活化剂，通过 KDR 在血管发生和细胞存活中起着重要作用。但是，还没有报道关于卵泡细胞中 VEGF 的信号转导通路。我们已经发现在体内，通过 TRAP intrabursal administration 抑制 VEGF 可在大鼠卵泡中诱导细胞凋亡，抑制细胞增生，调节卵泡生长和发育，P13K/AKT 信号通路是这个机制中的一种。但是，我们不能说明这个影响在体内发生是通过血管延伸减少或者是抑制卵泡细胞中 VEGF 与它的受体间的相互作用。我们的主要目的是研究来自

7、 DES-处理的大鼠的卵泡和颗粒细胞中 VEGF 的直接的存活作用。我们特别研究了体外在早期卵泡和颗粒细胞中 VEGF 在卵泡细胞增殖和凋亡的作用。另外，我们试图去阐明在卵巢细胞中 PI3K/AKT and ERKs 1 and 2 细胞内途径与 VEGF的直接作用是有关的。2.材料和方法2.1 试剂DMEM-F12,双抗，羊 FSH，人 VEGF，抗 PCNA 抗体 PCNA (sc-7907), Caspase 3 (sc-7148), phospho AKT (sc-7985-R), ERK (sc-154) and phospho ERK (sc-7383)，2.2 动物青春期钱的母大

8、鼠，皮下注射雌激素（己烯雌酚） ，连续 3 天来刺激早期卵泡的发育2.3 卵泡培养将卵泡（350 直径）洗干净在培养基内培养。60 个从 5 只动物上取下的卵巢卵泡混在一起用于不同的处理。4 分之一的卵泡在无血清的培养基中孵育（37 C，350ulDMEM/F12,包含有 10 mM HEPES，含有双抗） 。有研究用这种培育条件检测出卵巢卵泡生理学上的调节功能。另外，这种实验模型维持了卵泡的结构和不同卵泡细胞将的相互作用。用 DES 处理未成熟大鼠来刺激卵巢卵泡的发育可以是分离的卵泡呈现出早期卵泡的特征：大小，小空泡，薄的壳层。另外，有些研究利用这个模型研究在早期卵泡中的凋亡机制。将卵泡在无

9、血清的培养基中培养 24h 研究器凋亡和增殖，and for 60 min for intracellular pathways studies。在不同的条件下：无血清，加入 FSH 或 VEGF。在细胞凋亡研究中， 10 个从不同卵巢取来的卵泡培养与相同的培养基中 24h。在无血清中培养出现了典型的凋亡 DNA 条带：180bp 长的核小体间的片度出现。在相同的培育时间之后，将卵泡冻存在-70C 中，用于后续的蛋白或 DNA 的提取。2.4western blot提取卵泡蛋白2.5DNA 提取及破碎分析2.6 颗粒细胞分离和培养从 DES 处理的大鼠上分离颗粒细胞。放入 96 孔板或 8 孔

10、板中。先将细胞培养在含有BSA，胰岛素，转铁蛋白，维生素 C 3 的 DMEM/F12 中小时，之后将未贴壁的细胞转移到新鲜的富集培养基中 24h，之后将培养基换为含有 FSH 和雌二醇包含 VEGF 或不含 VEGF的 DMEM/F12 中。2.7 增殖分析氚化胸腺嘧啶在细胞培育 24h 之后加入。24h 之后，将细胞收集到凹玻片中，将多余的氚化胸腺嘧啶用酒精冲洗，之后用蒸馏水冲洗。用闪烁计数器计量放射性。每个实验包含 6 到 8 个重复，每个实验进行 3 次大重复，是不同的颗粒细胞组，他们从 6 只大鼠上获得。2.8TUNEL 染色用 tunel 鉴定颗粒细胞凋亡。2.9 数据分析3结果3

11、.1VEGF 可以刺激细胞增殖VEGF 对与卵泡细胞的增殖作用是通过鉴定 PCNA（增殖细胞核抗原）的表达，它在 G1和 S 期有表达。加有 VEGF(100ng/ml)的分离的早期卵泡可以明显的增强卵泡 PCNA 蛋白含量，与其他条件下比较。当卵泡培养在含有 FSH 或 VEGF(50ng/ml)的培养基中时，我们没有检测出来细胞增殖。图一VEGF 对卵泡 PCNA 蛋白表达的直接影响。对蛋白提取物（DES 处理的大鼠的早期卵泡用不同的方法处理）中的 PCNA 进行免疫印迹分析。卵泡培养在没有刺激物，含有FSH20ng/ml,VEGF50ng/ml,or 100ng/ml 的基本培养基中。光

12、密度测定法分析。5 个独立实验，3 次重复。星号表示显著差异。3.2 在体外研究中，VEGF 抑制细胞凋亡，降低卵泡细胞中 caspase 3 的活性细胞凋亡后期，细胞 DNA 断裂成 180bp 长的碎片，可以在琼脂糖凝胶中观察出来。由于自然凋亡，卵巢培养 24 小时后，可以观察到典型的凋亡细胞的 DNA 降解。早以前的研究中，我们证实了通过 TRAP 处理抑制 VEGF 可以导致大量的卵泡闭锁。因此我们接着研究VEGF 是否能直接调控卵泡闭锁。两种剂量的 VEGF（50，100ng/ml）都能明显降低细胞凋亡的 DNA 碎片，高浓度的剂量最用更明显。（图 2A）.FSH 同样可以降低自然凋

13、亡。、图 2在体外研究中，VEGF 抑制细胞凋亡，降低卵泡细胞中 caspase 3 的活性。(A)在 24 小时中通过不同的刺激（FSH,VEGF50ng/ml,100ng/ml）用琼脂糖凝胶分析早期卵泡 DNA 片段图，鉴定细胞凋亡。（B）在卵泡中密度计量 caspase 3 活性片段。caspase 3 蛋白可以用抗 caspase 3 抗体直观的现象出来。我们观察到卵泡细胞中 VEGF 可以减少细胞凋亡，我们接着研究了这种抑制是否伴随着 caspase 3 活性的降低。我们对卵泡中的蛋白提取物中的 caspase 3 的活性片段进行了western blot。VEGF 浓度物 50ng

14、/ml 时，减少了 caspase 3 的 p17 活性片段，与对照组比较。FSH 有相同的作用。意外的是，我们不能检测出对照组和加了 100ng/mlVEGF 的实验组的差别，可能是 VEGF 有双向的作用。3.3 VEGF 刺激颗粒细胞增殖为了研究 VEGF 对细胞的保护作用是直接作用与颗粒细胞的细胞因子，我们离体培养了颗粒细胞并培育与不同的条件下，如上所述。我们首先用 3H-Thymidine 核素掺入法分析了细胞的增值指数。得到同时用 FSH 和雌二醇，能增加 Thymidine。有趣的是，当加入50ng/ml 或 100ng/ml 的 VEGF 时，颗粒细胞的增殖效果会增强。图 3V

15、EGF 对颗粒细胞的增殖和凋亡的影响。（A）从早期卵泡分离的颗粒细胞培养在不含刺激物的基础培养基中，加有 FSH 和 E2，加有 FSH+E2+50ng/mlVEGF 或100ng/mlVEGF。（B）用 tunel 染色鉴定凋亡细胞。这些柱形显示了不同处理下的凋亡细胞的百分比。3.4 VEGG 抑制颗粒细胞凋亡知道了在卵泡中 VEGF 可以抑制卵泡细胞凋亡，我们通过 tunel 染色，进一步研究了在离体颗粒细胞中是否会发生细胞凋亡。就像前面描述的那样，将颗粒细胞放入 FSH 和雌二醇中孵育，的确可以降低凋亡细胞的百分比。另外，加入 50ng/mlVEGF,作用比加入100ng/mlVEGF

16、作用更明显。而 100ng/ml 的作用与 50 或其他加入刺激物的实验组的作用没有显著的区别。（图 3B）3.5 VEGF 激活了 AKT 和 ERK 的胞内途径我们研究 VEGF 对卵泡存活和细胞凋亡调节的机制。因此，我们研究了 VEGF 的作用是否影响了卵泡 P13K/AKT 途径。我们首先将卵泡孵育在基础培养基，含有 FSH,含有 50VEGF,含有 100VEGF 的不同处理中 1 小时。之后，我们用 western blot 鉴定了总的 AKT 和磷酸化的 AKT。如（图 4A）所示，当将卵泡孵育在含有 100ng/ml 的细胞因子中时，VEGF 现出增加了 AKT 的磷酸化水平。

17、在相同时间点，对于 50VEGF 的处理，我们不能检测出来任何的影响。图 4在卵巢中 VEGF 对 AKT 和 ERK 磷酸化的直接影响。将卵泡孵育在不同条件中 60 分钟后，用光密度定量法测定蛋白提取物中的 AKT(A)和 ERK(B)的磷酸化水平。每一个蛋白都用actin B 标准化。下方都是每一个组的免疫印迹。（图 4B）4.讨论在此研究中，我们证实了对于从经过 DES 处理的青春期前的大鼠体内取出的卵巢和颗粒细胞，VEGF 起着增殖和保护细胞的角色。对于 VEGF 对内皮细胞的效应，研究的比较多，在去年，大量的研究证实 VEGF 在非血管性的细胞如：神经元细胞，和肌细胞中扮演着存活角色

18、。到目前为止，很少有研究是关于 VEGF 在卵巢中的非血管性组织中的存活作用。为了分析 VEGF 对于卵巢细胞的影响，我们首先用的到的模型是体外培养的早期卵泡，它可以保护卵泡的结构，研究不同卵泡细胞间的相互作用。用这个方法，我们证实了当在大鼠卵巢培养基中加入 VEGF 后，可以刺激卵巢细胞的增殖。这个结果与先前我们在体内局部抑制卵巢 VEGF 的表达所得的结论是一致的：VEGF 促进颗粒细胞和卵泡膜细胞的增殖。这也与其他的研究者一致：当在灵长类卵巢中抑制 VEGF，可以抑制卵泡膜细胞的增殖。另外，还有研究指出在山羊中，VEGF 可以改善卵泡超微结构的完整性，促进卵泡生长。这些研究都说明在发育的

19、卵泡中 VEGF 通过与颗粒细胞或卵泡膜细胞中的受体作用，在自分泌和旁分泌中起到了促有丝分裂的作用。不论早期卵泡的发育不完全的血管网，我们不能排除VEGF 对内皮细胞有可能由作用。另一方面，我们分析了 VEGF 对卵泡细胞凋亡的作用。将卵泡培养在无血清的培养基中 24 小时，提取的 DNA 显示了典型的凋亡细胞的 DNA 降解。加入 FSH（已知的较好的卵巢卵泡存活因子）可以减少细胞凋亡的 DNA 碎裂片。我们的研究证实在培养基中加入 VEGF 可以得到与 FSH 相同的结果。而且，将早期卵泡培育在无血清的培养基中，VEGF 可以抑制caspase 3 的活性。有些研究证明了在不同类型的细胞如

20、胚胎神经元 VEGF 可以干扰caspase 3 的激活抑制细胞凋亡。在我们的研究中得到，在卵泡细胞中 VEGF 扮演着存活因子的作用（通过 caspase 依赖的机制）为了进一步分析 VEGF 在卵泡细胞中的作用，我们研究了它对颗粒细胞可能的直接功能。已经知道大鼠和其他物种的颗粒细胞在卵泡发育过程中表达 KDR 是有差别的。有研究证实了在牛健康颗粒细胞中 VEGF 和它的受体是共表达的。与他们一致，我们最近证实了VEGF 和它的受体在大鼠卵泡发育的全程中可以增加表达。为了研究 VEGF 对颗粒细胞的直接作用，我们离体培养青春期前的大鼠颗粒细胞，用 diethylestilbestr 处理。当

21、细胞用 FSH 和雌二醇处理后，我们观察到卵泡增殖。这个现象我们在以前就描述过，其他也有研究。当用 FSH，VEGF，雌二醇共同处理细胞后，我们发现 tritiated thymidine 显著增加。当 VEGF 单独作用时，它对细胞增殖并没有作用。这些结果说明 VEGF 与 FSH 和雌二醇对颗粒细胞增殖有着协同作用。对于猪颗粒细胞，VEGF 单独作用也可以刺激颗粒细胞增殖。我们的研究指出，对于从大鼠早期卵泡中的颗粒细胞来说，VEGF 单独作用不会影响细胞增殖，但是却可以加强 FSH 和雌二醇促使细胞生长的能力。FSH 和 VEGF 对早期卵泡或颗粒细胞影响中的差别可能是由于在颗粒细胞中 F

22、SH 受体的易受性或是在卵泡中与其他因子的相互作用。众所周知，对于不同的物种和细胞类型，VEGF 是一个存活因子，通过在内皮细胞和非内皮细胞如：神经元，肌细胞，内皮细胞和卵巢细胞中的 KDR 受体发生作用，使他们减少细胞凋亡。通过 tunel 染色，我们发现对于从大鼠早期卵泡中的颗粒细胞来说，VEGF 单独作用不会影响颗粒细胞凋亡水平，但是却可以加强 FSH 和雌二醇对颗粒细胞的保护作用。我们总结出，在卵泡细胞中 VEGF 不是作为一个增殖因子，而是起到一个保护的作用，组织颗粒细胞凋亡，防止卵泡闭锁。这些作用发生在 VEGF 与 FSH 和雌二醇协同作用的时候。值得指出的是，在卵泡发育时期，我

23、们抑制 VEGF 得到了相似的结果：凋亡的颗粒细胞数目增加，自然的 DNA 断裂碎片增多，caspase 3 活性提高。但是，用这个实验模型我们不能区别这个影响是由于为卵泡供养的血管减少的原因还是卵泡细胞 VEGF 与其受体直接作用的原因。这个研究证实了 VEGF 通过与 FSH 和雌二醇协同作用直接影响了卵泡细胞，阻止细胞凋亡，刺激细胞增殖，促进卵泡发育，促进排卵。（thus promoting follicular development and selection of the follicle to ovulate。）因此，与其他生长因子一起，增加 VEGF 的活性是机制的一部分：在含

24、有相同 FSH 的条件下更能是卵泡发育好一些。VEGF 在不同的细胞中可以激活 P13K/AKT 途径，如内皮细胞，平滑肌细胞。我们最近报道了在大鼠体内，在卵泡发育期抑制 VEGF 可以 AKT 的磷酸化。在目前的研究中，我们验证 VEGFS 是通过活化 P13K/AKT 途径来直接作用与卵泡细胞的。事实上，我们观察到，当将VEGF 加入到含有不同刺激物的早期卵泡培养基中是，可以是 AKT 在丝氨酸 473 的磷酸化程度增加。相反，FSH 不能激活 AKT。但是，有证据表明在许多细胞中 FSH 可以刺激P13K/AKT 的信号传导，如支持细胞，卵母细胞，颗粒细胞。这些不一致可能由于细胞的类型和

25、对 FSH 分析时的曝光时间有关。除了知道 VEGF 对 P13K/AKT 途径的活化作用，还有一些证据表明 VEGF 还可以刺激ERK1/2 信号。ERK 主要是通过生长因子或有丝分裂原的刺激来促使细胞分化，生长，存活。在内皮细胞和神经元细胞中 VEGF 通过 FLK-1/KDR 受体和 ERK1/2 刺激 DNA 合成和增殖。有趣的是，在我们的实验模型中，我们观察到 FSH 和 VEGF 都可以增加 ERK1/2D 磷酸化。我们推测 VEGF 在卵泡细胞中通过刺激两个信号传导机制来发挥它的存活活性，P13K/AKT 和 ERK胞内途径。但是，我们不能排除在大鼠卵巢中，VEGF 还影响了其他

26、的途径。在目前的工作中，我们发现在一些凋亡数据的分析中 VEGF 在不同浓度下的作用有一些差别。这可以归咎于 VEGF 在我们实验模型中的双向作用。值得注意的是，有些研究也指出 VEGF 在不同的细胞间对于细胞分化和胞内介质的磷酸化有着双向作用。事实上，Meng dt al.证实了在成熟小鼠的神经元细胞中，大剂量的外源性 VEGF 显著的负调节内源性的KDR 和 FLT1 的表达，相反，小剂量的则能显著的正调节。双向作用也被报道在其他生长因子上发现，如转化生长因子 (TGF)。把我们的结果总结起来发现 VEGF 除了能增加血管通透性，促进血管生长，更重要的是在非血管性的卵巢细胞中 VEGF 能

27、阻止细胞凋亡，促进细胞增殖，防止卵泡闭锁。VEGF 在大鼠卵巢细胞中可以起到局部的细胞增殖和细胞保护的作用。我们也证实了胞内途径有可能与 VEGF 的特殊的作用有关。此外，我们证 VEGF 的一些功能是由于它直接作用在了颗粒细胞上。总的来说，在大鼠早期卵泡细胞中（特别是颗粒细胞）VEGF 刺激细胞增殖，阻止卵泡闭锁。它也可以抑制 caspase 3 的活性。而且，P13K/AKT 和 ERK/MEK 途径都与 VEGF 的局部作用有关。PCNA: 增殖细胞核抗原，因其只存在于正常增殖细胞及肿瘤细胞内而得名，以后的研究发现PCNA 与细胞 DNA 合成关系密切，在细胞增殖的启动上起重要作用，是反

28、映细胞增殖状态的良好指标。P CNA 是 一 种 分 子 量 为 36KD 的 蛋 白 质 ， 在 细 胞 核 内 合 成 ， 并 存 在 于 细 胞核 内 ， 为 DNA 聚 合 酶 的 辅 助 蛋 白 。 在 细 胞 核 内 存 在 可 溶 性 与 不 溶 性 两 种 PCNA， 可溶 性 PCNA 在 细 胞 周 期 各 期 中 均 有 表 达 ， 其 量 在 DNA 合 成 过 程 中 不 发 生 明 显 变 化 ， 易被 去 污 剂 提 取 、 甲 醇 破 坏 ； 不 溶 性 PCNA 较 稳 定 ， 不 易 被 去 污 剂 洗 脱 、 甲 醇 破 坏 ， 这种 PCNA 在 G0

29、G1 期 细 胞 中 无 明 显 表 达 ， G1 晚 期 ， 其 表 达 大 幅 度 增 加 ， S 期 达 到 高峰 ， G2 M 期 明 显 下 降 ， 其 量 的 变 化 与 DNA 合 成 一 致 ， 检 测 其 在 细 胞 中 的 表 达 ， 可 作为 评 价 细 胞 增 殖 状 态 的 一 个 指 标 1,2,4。ERK胞 外 信 号 调 节 激 酶 -ERK从 细 胞 外 刺 激 作 用 于 细 胞 ,至 细 胞 出 现 相 应 的 生 物 学 效 应 ,须 通 过 MAPK 信 号 转 导通 路 的 三 级 激 酶 级 联 反 应 。 细 胞 外 调 节 蛋 白 激 酶(ex

30、tracellularregulatedproteinkinases,ERK)包 括 ERKl 和 ERK2,是 将 信 号 从 表 面 受 体 传导 至 细 胞 核 的 关 键 。 磷 酸 化 激 活 的 ERKl/2 由 胞 质 转 位 到 核 内 ,进 而 介 导 Elk-1,ATF,NF-B,Ap-1,c-fos 和 c-Jun 的 转 录 活 化 ,参 与 细 胞 增 殖 与 分 化 、 细 胞 形 态 维 持 、细 胞 骨 架 的 构 建 、 细 胞 凋 亡 和 细 胞 的 恶 变 等 多 种 生 物 学 反 应 。 遵 循 MAPKs 的 三 级 酶促 级 联 反 应 ， 即 上

31、 游 激 活 蛋 白 MAPK 激 酶 的 激 酶 （ MAPKKK） MAPK 激 酶（ MAP-KK） MAPK细 胞 凋 亡1） DNA 的 片 段 化 细 胞 凋 亡 的 一 个 显 著 特 点 是 细 胞 染 色 体 的 DNA 降 解 ， 这 是 一 个 较 普 遍 的 现 象 。 这 种 降 解 非 常 特 异 并 有 规 律 ， 所 产 生 的 不 同 长 度 的 DNA 片 段 约 为 180-200bp 的整 倍 数 ， 而 这 正 好 是 缠 绕 组 蛋 白 寡 聚 体 的 长 度 ， 提 示 染 色 体 DNA 恰 好 是 在 核 小 体 与核 小 体 的 连 接 部

32、位 被 切 断 ， 产 生 不 同 长 度 的 寡 聚 核 小 体 片 段 ， 实 验 证 明 ， 这 种 DNA的 有 控 降 解 是 一 种 内 源 性 核 酸 内 切 酶 作 用 的 结 果 ， 该 酶 在 核 小 体 连 接 部 位 切 断 染 色 体DNA， 这 种 降 解 表 现 在 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 中 就 呈 现 特 异 的 梯 状 Ladder 图 谱 ， 而 坏 死 呈 弥漫 的 连 续 图 谱 。Caspase 3即 半 胱 天 冬 蛋 白 酶 在 凋 亡 过 程 中 是 起 着 必 不 可 少 的 作 用 ， 细 胞 凋 亡 的 过 程 实 际 上是 Casp

33、ase 不 可 逆 有 限 水 解 底 物 的 级 联 放 大 反 应 过 程 ， 到 目 前 为 止 ， 至 少 已 有 14 种Caspase 被 发 现 ， Caspase 分 子 间 的 同 源 性 很 高 ， 结 构 相 似 ， 都 是 半 胱 氨 酸 家 族 蛋 白 酶 ，根 据 功 能 可 把 Caspase 基 本 分 为 二 类 ： 一 类 参 与 细 胞 的 加 工 ， 如 Pro-IL-1 和 Pro-IL-1， 形 成 有 活 性 的 IL-1 和 IL-1； 第 二 类 参 与 细 胞 凋 亡 ， 包 括 caspase2,3,6,7,8,9.10AktAkt 又 称

34、 PKB， 即 蛋 白 激 酶 B， 是 一 种 丝 氨 酸 /苏 氨 酸 蛋 白 激 酶 ， 在 细 胞 存 活 和 凋亡 中 起 重 要 作 用 。 胰 岛 素 等 生 长 和 存 活 因 子 都 可 以 激 活 Akt 信 号 途 径 。 Akt 的Ser473 可 以 被 PDK1 磷 酸 化 。 PI3K 即 磷 脂 酰 肌 醇 -3 激 酶 ， PI3K-Akt 信 号 途 径 是 一 条经 典 的 信 号 途 径 ， LY294002 等 PI3K 的 抑 制 剂 抑 制 PI3K 时 ， 即 可 抑 制 PIP3 的 生 成 ，阻 断 了 Akt 的 活 化 。 Akt 能 磷

35、 酸 化 一 系 列 蛋 白 成 分 ， 通 过 多 种 途 径 抑 制 细 胞 凋 亡 。P I 3 K A k t 通 路 被 认 为 是 癌 细 胞 存 活 的 首 要 通 路 。 有 “ 抗 凋 亡 途 径 ”之 称 。 P I 3 K 是 一 种 胞 内 磷 脂 酞 肌 醇 激 酶 ， 本 身 具 有 S e r T h r ( 丝 氨 酸 苏 氨 酸 ) 激 酶 的 活 性 ， 也 具 有 磷 脂 酞 肌 醇 激 酶 的 活 性 。 P I 3 K 是 许 多 生 命 活动 中 关 键 的 信 号 分 子 ， P I 3 K 介 导 的 信 号 转 导 通 路 可 以 调 节 细

36、胞 的 分 裂 、 分化 、 凋 亡 等 活 动 。 近 年 发 现 ， Ak t 是 P I 3 K 下 游 直 接 的 靶 蛋 白 ， 具 有丝 氨 酸 苏 氨 酸 残 基 ， 可 直 接 被 P I 3 K 激 活 ， 也 可 以 被 P I 3 K 激 活 的 P D K1 和 P DK 2 激 活 。 在 P I 3 K 途 径 中 ， 当 上 游 信 号 刺 激 细 胞 膜 表 面 时 ， 穿膜 受 体 酪 氨 酸 激 酶 自 磷 酸 化 或 磷 酸 化 其 他 底 物 后 ， 可 在 细 胞 膜 内 表 面 产 生 P I 3 K 结 合 位 点 ， P I 3 K 结 合 后 可 产 生 一 些 磷 脂 ， 激 活 其 下 游 的 A k t ， 活 化 的 A k t ( p A k t ) 可 介 导 各 种 类 型 的 细 胞 生 长 、 生 存 和 分 化 ， 同 时 还 可 上 调 抗凋 亡 基 因 的 表 达 ， 抑 制 由 c my c 诱 导 的 细 胞 凋 亡 ， 或 活 化 细 胞 内 其 他信 号 转 导 通 路 ， 调 节 细 胞 的 适 应 性 生 存